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yusuya木虫 (小有名气)
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【求助/交流】请教XhoI与EcoRI双酶切问题已有6人参与
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本人用pDsRed-Monomer-C1质粒用XhoI与EcoRI双酶切后，想连接一段目的基因，可是总是连接不上，而且一直是自连，CAGATC‘TCGA’GCTCAAGCTTCG‘AATT’CT GTCTAG‘AGCT’CGAGTTCGAAGC‘TTAA’GA XhoI EcoRI 希望高人指点下都什么原因会造成自连呢？两个酶切的位点很近是不是会造成影响呢？ |
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2楼2010-04-15 15:47:32
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6楼2010-04-15 19:20:08
yusuya(金币+1): 2010-04-16 15:51
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我记得XhoI和EcoRI，如果使用NEB的酶的话，双酶切要用EcoRI对应的Buffer. 不过对于第一次做酶切质粒，单酶切也要一起做。 如果单酶切没问题，双酶切也应该问题不大，虽然距离比较近，效率低一些。 如果再不行，那就改为分步酶切，先做难切的那个，但是Buffer要用两者都适用的那种； 如果还不行，那就先连接到克隆载体上，比如pGEM之类的，因为用Taq酶PCR的时候会在两个末端加上A，而克隆载体一般都是线性的载体，两端都有T，所以按照试剂盒的操作很快就能完成，这样在酶切的肯定是没问题的，就是花点时间而已（我开始的时候也遇到酶切不行，自连的情况，不过我个人不建议用碱性磷酸酶来避免自连，觉得会降低效率，所以后来就用克隆载体先连接，在酶切，这样就好了）。 如果还是不行，那你只能用绝招了——LIC（Ligation independent cloning)，具体你可以参考文献，现在这个方法已经用的很成熟了，我们实验室还发明了chemical ligation的方法，只要10min就可以把基因片段和载体连上，而且连接效率95%，自连几乎为零，我已经用这个方法构建基因库了，不过要等paper发了再和大家分享吧。 这些是我的经验，希望对你有用！ |
7楼2010-04-16 06:52:21