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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】请教XhoI与EcoRI双酶切问题
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yusuya

木虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】请教XhoI与EcoRI双酶切问题 已有6人参与

本人用pDsRed-Monomer-C1质粒用XhoI与EcoRI双酶切后，想连接一段目的基因，可是总是连接不上，而且一直是自连，CAGATC‘TCGA’GCTCAAGCTTCG‘AATT’CT
                                                            GTCTAG‘AGCT’CGAGTTCGAAGC‘TTAA’GA
                                                                         XhoI                             EcoRI   
希望高人指点下都什么原因会造成自连呢？两个酶切的位点很近是不是会造成影响呢？
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1楼 2010-04-15 14:39:32
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雨中蜗牛

金虫 (正式写手)
你要接的目的片段是不是没有黏性末端啊
pcr是不是延伸完就拿出来了，没有经过4度20分钟啊？
这样的话就不好接
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■如果如果有一天?k忘記了沵爾一定要記得曾經有一個傻孩子?圻^爾
4楼2010-04-15 17:32:15
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genewind

金虫 (小有名气)
yusuya(金币+1): 2010-04-15 21:24
双酶切效率会低点，你可以试试按顺序一个酶切后沉淀纯化后再用另一个酶切，一般1ug的DNA用5个U的酶。
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2楼2010-04-15 15:47:32
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amilie030312

金虫 (正式写手)
yusuya(金币+1): 2010-04-15 21:24
先单酶切看看，看是否效率一样，确定两个酶都没有问题。如果两个酶都确定了没问题就用热敏磷酸酶做一下去磷酸化，这样起码能减少自连的情况发生几率。连接的时候做一下自连的做对照，确认是否真的是自连了。其他的暂时没想到。
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3楼2010-04-15 17:10:16
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小白3521

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by 雨中蜗牛 at 2010-04-15 17:32:15:
你要接的目的片段是不是没有黏性末端啊
pcr是不是延伸完就拿出来了，没有经过4度20分钟啊？
这样的话就不好接

这是什么原理啊
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5楼2010-04-15 19:09:26
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