| 查看: 1467 | 回复: 6 | |||
| 当前主题已经存档。 | |||
| 【有奖交流】积极回复本帖子，参与交流，就有机会分得作者 yusuya 的 1 个金币 | |||
| 当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖 | |||
yusuya木虫 (小有名气)
|
[交流]
【求助/交流】请教XhoI与EcoRI双酶切问题 已有6人参与
|
||
|
本人用pDsRed-Monomer-C1质粒用XhoI与EcoRI双酶切后，想连接一段目的基因，可是总是连接不上，而且一直是自连，CAGATC‘TCGA’GCTCAAGCTTCG‘AATT’CT GTCTAG‘AGCT’CGAGTTCGAAGC‘TTAA’GA XhoI EcoRI 希望高人指点下都什么原因会造成自连呢？两个酶切的位点很近是不是会造成影响呢？ |
回复此楼» 猜你喜欢
不合理蛙科研实验中的趣事：实验器材的 “乌龙”
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验中的趣事：和实验材料的 “斗智斗勇”
已经有0人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有128人回复
-
蛋白质检测：精准分析，解锁生物分子的密码
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之小鼠实验：严谨设计，解析生命机制的重要载体
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之重金属检测：精准筛查，守护健康与环境的防线
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之“蛙测重金属我背锅三千”
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之“鼠逃三次我发三篇SCI”
已经有0人回复
-
纳米粒度分析
已经有3人回复
-
林科院林化所招收材料与化工专业硕士，坐标南京
已经有0人回复
yusuya(金币+1): 2010-04-16 15:51
|
我记得XhoI和EcoRI，如果使用NEB的酶的话，双酶切要用EcoRI对应的Buffer. 不过对于第一次做酶切质粒，单酶切也要一起做。 如果单酶切没问题，双酶切也应该问题不大，虽然距离比较近，效率低一些。 如果再不行，那就改为分步酶切，先做难切的那个，但是Buffer要用两者都适用的那种； 如果还不行，那就先连接到克隆载体上，比如pGEM之类的，因为用Taq酶PCR的时候会在两个末端加上A，而克隆载体一般都是线性的载体，两端都有T，所以按照试剂盒的操作很快就能完成，这样在酶切的肯定是没问题的，就是花点时间而已（我开始的时候也遇到酶切不行，自连的情况，不过我个人不建议用碱性磷酸酶来避免自连，觉得会降低效率，所以后来就用克隆载体先连接，在酶切，这样就好了）。 如果还是不行，那你只能用绝招了——LIC（Ligation independent cloning)，具体你可以参考文献，现在这个方法已经用的很成熟了，我们实验室还发明了chemical ligation的方法，只要10min就可以把基因片段和载体连上，而且连接效率95%，自连几乎为零，我已经用这个方法构建基因库了，不过要等paper发了再和大家分享吧。 这些是我的经验，希望对你有用！ |
7楼2010-04-16 06:52:21
genewind
金虫 (小有名气)
- 应助: 0 (幼儿园)
- 金币: 1322.2
- 散金: 2
- 帖子: 198
- 在线: 115.5小时
- 虫号: 416913
- 注册: 2007-06-30
- 性别: GG
- 专业: 基因表达调控与表观遗传学
2楼2010-04-15 15:47:32
amilie030312
金虫 (正式写手)
- MolEPI: 2
- 应助: 7 (幼儿园)
- 金币: 644.8
- 帖子: 407
- 在线: 47.3小时
- 虫号: 296900
- 注册: 2006-11-18
- 专业: 动物遗传学
3楼2010-04-15 17:10:16
雨中蜗牛
金虫 (正式写手)
- 应助: 1 (幼儿园)
- 金币: 1839.2
- 散金: 61
- 红花: 1
- 帖子: 650
- 在线: 32.1小时
- 虫号: 940748
- 注册: 2010-01-11
- 专业: 兽医传染病学
4楼2010-04-15 17:32:15
