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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】连接 酶切的问题
汕头大学海洋科学接受调剂
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wbfree

铜虫 (初入文坛)

[交流] 【求助/交流】连接 酶切的问题

我的目的片段4000bp，PCR回收效果很好，用pMD19-T载体连接、转化之后做酶切，但是酶切之后只有略小于载体片段的带型，请哪位高手指点一下 ，是不是没有连上，还是没有切开？谢谢
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1楼 2010-03-18 10:04:21
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gaozx123

金虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
转化有没有做蓝白斑筛选啊，应该做一个，然后可以再做一个菌落PCR验证一下。确定之后再酶切检测一下。
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2楼2010-03-18 10:08:47
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fungixx

至尊木虫 (文坛精英)

优秀版主优秀版主优秀版主
★
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我觉得你应该连进去了，pMD19-T载体有3351bp（是这么大吗？），然而你连进去的片段有4000bp，那么连进去这后你跑质粒就应该对照看出来大了很多。
    如果你酶切验证时，4000bp和3350bp如果不跑的时间长点应该不好分开就像一条带吧，所以你可能误以为没有连进去或者变小了，所以你应该把胶浓度配的小点7-8%，然后跑的时间长点，应该能看清楚的
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几年前踏上火车那一刻都还没有意识到,从此故乡只有冬夏,再无春秋
3楼2010-03-18 10:28:16
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yujiaping1

木虫 (著名写手)
胶回收的时候，看起来片段要大一点，质粒酶切后看起来又小了点，正常的，只要确实是有载体片段有目的片段，应该是连进去了
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4楼2010-03-18 10:42:13
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wbfree

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
Originally posted by gaozx123 at 2010-03-18 10:08:47:
转化有没有做蓝白斑筛选啊，应该做一个，然后可以再做一个菌落PCR验证一下。确定之后再酶切检测一下。

我做蓝白斑筛选了，没有做菌液PCR，直接提的质粒DNA酶切的，酶切之后只有一条略小于载体的带，我觉得是没有连接上。
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5楼2010-03-19 08:58:09
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wbfree

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
Originally posted by fungixx at 2010-03-18 10:28:16:
我觉得你应该连进去了，pMD19-T载体有3351bp（是这么大吗？），然而你连进去的片段有4000bp，那么连进去这后你跑质粒就应该对照看出来大了很多。
    如果你酶切验证时，4000bp和3350bp如果不跑的时间长点应该不 ...

pMD-19T的大小是2692bp，而我跑的PCR带只有略小于载体的一条带。我觉得还是没有连上
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6楼2010-03-19 09:52:40
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yujiaping1

木虫 (著名写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
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Originally posted by wbfree at 2010-03-19 09:52:40:

pMD-19T的大小是2692bp，而我跑的PCR带只有略小于载体的一条带。我觉得还是没有连上

你注意你的Marker，你有可能将目标片段和载体片段弄反了，你要用大一些的Marker来比对
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7楼2010-03-19 12:55:48
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