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wbfree

铜虫 (初入文坛)

[交流] 【求助/交流】连接 酶切的问题

我的目的片段4000bp,PCR回收效果很好,用pMD19-T载体连接、转化之后做酶切,但是酶切之后只有略小于载体片段的带型,请哪位高手指点一下 ,是不是没有连上,还是没有切开?谢谢
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yujiaping1

木虫 (著名写手)


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引用回帖:
Originally posted by wbfree at 2010-03-19 09:52:40:

pMD-19T的大小是2692bp,而我跑的PCR带只有略小于载体的一条带。我觉得还是没有连上

你注意你的Marker,你有可能将目标片段和载体片段弄反了,你要用大一些的Marker来比对
7楼2010-03-19 12:55:48
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gaozx123

金虫 (小有名气)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
转化有没有做蓝白斑筛选啊,应该做一个,然后可以再做一个菌落PCR验证一下。确定之后再酶切检测一下。
2楼2010-03-18 10:08:47
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fungixx

至尊木虫 (文坛精英)

优秀版主优秀版主优秀版主


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
我觉得你应该连进去了,pMD19-T载体有3351bp(是这么大吗?),然而你连进去的片段有4000bp,那么连进去这后你跑质粒就应该对照看出来大了很多。
    如果你酶切验证时,4000bp和3350bp如果不跑的时间长点应该不好分开就像一条带吧,所以你可能误以为没有连进去或者变小了,所以你应该把胶浓度配的小点7-8%,然后跑的时间长点,应该能看清楚的
几年前踏上火车那一刻都还没有意识到,从此故乡只有冬夏,再无春秋
3楼2010-03-18 10:28:16
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yujiaping1

木虫 (著名写手)

胶回收的时候,看起来片段要大一点,质粒酶切后看起来又小了点,正常的,只要确实是有载体片段有目的片段,应该是连进去了
4楼2010-03-18 10:42:13
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