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wbfree

铜虫 (初入文坛)

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[交流] 【求助/交流】连接酶切的问题

我的目的片段4000bp，PCR回收效果很好，用pMD19-T载体连接、转化之后做酶切，但是酶切之后只有略小于载体片段的带型，请哪位高手指点一下，是不是没有连上，还是没有切开？谢谢

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1楼 2010-03-18 10:04:21

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wbfree

铜虫 (初入文坛)

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引用回帖:

Originally posted by fungixx at 2010-03-18 10:28:16:
我觉得你应该连进去了，pMD19-T载体有3351bp（是这么大吗？），然而你连进去的片段有4000bp，那么连进去这后你跑质粒就应该对照看出来大了很多。
如果你酶切验证时，4000bp和3350bp如果不跑的时间长点应该不 ...

pMD-19T的大小是2692bp，而我跑的PCR带只有略小于载体的一条带。我觉得还是没有连上

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6楼2010-03-19 09:52:40

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gaozx123

金虫 (小有名气)

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小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流

转化有没有做蓝白斑筛选啊，应该做一个，然后可以再做一个菌落PCR验证一下。确定之后再酶切检测一下。

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2楼2010-03-18 10:08:47

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fungixx

至尊木虫 (文坛精英)

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我觉得你应该连进去了，pMD19-T载体有3351bp（是这么大吗？），然而你连进去的片段有4000bp，那么连进去这后你跑质粒就应该对照看出来大了很多。
如果你酶切验证时，4000bp和3350bp如果不跑的时间长点应该不好分开就像一条带吧，所以你可能误以为没有连进去或者变小了，所以你应该把胶浓度配的小点7-8%，然后跑的时间长点，应该能看清楚的

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几年前踏上火车那一刻都还没有意识到,从此故乡只有冬夏,再无春秋