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听雪看山

木虫 (职业作家)

西游家族之T所长

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[交流] 【求助/交流】单酶切载体竟然没切开，寻求原因？？已有5人参与

我用的载体是5500bp，酶是XmaI，去过磷酸化的。这个酶切已经做过n多次了，插入基因就是没办法和载体连接上，自连现象严重。当时以为是去磷酸化步骤的问题，然后就做过2次去磷酸化。
   后来在做完酶切后做了一个转化，将50ng酶切液用电子穿孔仪转入感受态细胞，隔夜培养后发现n多菌斑，那就是意味着没有酶切成功，心里这个郁闷啊！
   我用的这个酶据说是比较难反应的，所以当时酶切都是隔夜至少10个小时以上了！！

   我现在真的是一点办法也没有了，本来就是新手，第一次做，竟然还碰到这么大的问题，3个月了，一点进展都没有，着急啊！
   恳请高手们给点建议，小虾米在这多谢了！！

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开花可要欣赏，然后就去远行；唯有不等花开，才能记得花红。

1楼 2010-02-08 20:19:51

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引用回帖:

Originally posted by liyong1981 at 2010-05-05 11:09:49:
顶住。不要急～

谢谢，经过好几个月，酶切没有问题了。因为用的XmaI在说明里要酶切过夜（16小时）才有更强的效力，后来做出了阳性克隆。

现在问题在于，用了高保真的酶做PCR的，可是3次测序回来序列都不理想，第一次的有一个突变点，第二次和第三次序列里居然出现了内含子。
超郁闷，按理来说cDNA克隆，不应该有内含子的，可是出现了！！不只是必然还是偶然？？