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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】双酶切，连接转化问题，急！
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zsm0507

金虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】双酶切，连接转化问题，急！

我构建表达载体，双酶切连接转化后不长阳性克隆，一个菌都不长，我重复了好多次了，酶切回收我跑电泳看了，PCR片段和载体差不多亮，浓度不是很浓但也可以，感受态也是别人用的可以我才用的，可是就是不长菌，就算长一两个菌也是假阳性，不知道则么回事，快愁死了，眼看快毕业了，也快放假了，郁闷呀，着急呀，请大家帮帮我吧！谢了
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1楼 2010-01-21 21:28:09
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ideal9268

铜虫 (小有名气)
确认你表达载体的抗性，看看涂板时抗性是不是加错了？
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2楼2010-01-21 21:39:12
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fungixx

至尊木虫 (文坛精英)

优秀版主优秀版主优秀版主
★
zsm0507(金币+1): 1-23 09:17
是不是pcr产物没有酶切开，怀疑：1保护碱基太少，2引物酶切位点合成错了。连接是pcr片段最少是质粒的三倍-------------------
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几年前踏上火车那一刻都还没有意识到,从此故乡只有冬夏,再无春秋
3楼2010-01-21 21:40:22
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Temin2009

木虫 (正式写手)
★ ★
zsm0507(金币+2): 1-23 09:15
根据你的描述，1、核对载体的抗性基因、LB平板的抗性；2、有条件的话，测一下酶切胶回收之后的载体和DNA片段浓度，调整连接体系的比例，比如1:3；3、T4DNA连接的温度，最佳的我觉得是16度过夜，然后室温连接2-3小时也行，4度过夜个人觉得连接效果不大好。4、T4 DNA的连接体系，10ul就很好用，感觉没必要20ul。
你是PCR扩增产物吗，也可以试试先做个TA克隆（如果是保真性酶，可能要加A），蓝白斑筛选一下，再从克隆载体上亚克隆到表达载体。
可能说的不清楚，再讨论。希望能有些帮助。
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4楼2010-01-21 21:41:34
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yujiaping1

木虫 (著名写手)
引用回帖:
Originally posted by Temin2009 at 2010-1-21 21:41:
根据你的描述，1、核对载体的抗性基因、LB平板的抗性；2、有条件的话，测一下酶切胶回收之后的载体和DNA片段浓度，调整连接体系的比例，比如1:3；3、T4DNA连接的温度，最佳的我觉得是16度过夜，然后室温连接2-3小 ...

楼上看来是高手，愿意留个QQ，经常一起讨论吗？或者你加我124759083，注明小木虫
我过去、现在、将来一直都是在从事生物科学
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5楼2010-01-21 22:01:32
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gaozx123

金虫 (小有名气)
★
zsm0507(金币+1): 1-23 09:17
敢问lz用的平板还是克隆转化的平板吗？检查一下你的表达质粒上是否有你的克隆载体上的抗性基因。这个一定要搞清楚。问题应该是出现在这了。
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6楼2010-01-22 09:01:17
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zsm0507

金虫 (小有名气)
先谢谢楼上各位！首先我觉得抗性肯定没有搞错，再次我预试验也做的很成功，而且我做的同一批中原来有一个200bp的成功了，可是700bp的，900bp的，1500bp,2000bp的没做出来。
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7楼2010-01-22 10:05:21
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towindflower

新虫 (初入文坛)
建议做阳性对照，阳性出来了再分析其他原因
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8楼2010-01-22 14:13:42
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
★
zsm0507(金币+1): 1-23 09:16
既然抗性什么之类的都没错
建议再检测一下感受态有没有问题，转个空质粒去看看
然后连接试试4度过夜，有可能是没连上
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9楼2010-01-22 14:24:47
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skkyy88888

铜虫 (著名写手)
★
zsm0507(金币+1): 1-23 09:16
连接酶效率低了吧。要不就是感受态的问题。其他可以不用考虑了。
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10楼2010-01-22 21:28:21
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