应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】双酶切，连接转化问题，急！
121/2返回列表12下一页
查看: 1341  |  回复: 11
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
当前主题已经存档。

zsm0507

金虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】双酶切，连接转化问题，急！

我构建表达载体，双酶切连接转化后不长阳性克隆，一个菌都不长，我重复了好多次了，酶切回收我跑电泳看了，PCR片段和载体差不多亮，浓度不是很浓但也可以，感受态也是别人用的可以我才用的，可是就是不长菌，就算长一两个菌也是假阳性，不知道则么回事，快愁死了，眼看快毕业了，也快放假了，郁闷呀，着急呀，请大家帮帮我吧！谢了
回复此楼

» 猜你喜欢
1楼 2010-01-21 21:28:09
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

ideal9268

铜虫 (小有名气)
确认你表达载体的抗性，看看涂板时抗性是不是加错了？
赞一下 回复此楼
2楼2010-01-21 21:39:12
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

fungixx

至尊木虫 (文坛精英)

优秀版主优秀版主优秀版主
★
zsm0507(金币+1): 1-23 09:17
是不是pcr产物没有酶切开，怀疑：1保护碱基太少，2引物酶切位点合成错了。连接是pcr片段最少是质粒的三倍-------------------
赞一下 回复此楼
几年前踏上火车那一刻都还没有意识到,从此故乡只有冬夏,再无春秋
3楼2010-01-21 21:40:22
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

Temin2009

木虫 (正式写手)
★ ★
zsm0507(金币+2): 1-23 09:15
根据你的描述，1、核对载体的抗性基因、LB平板的抗性；2、有条件的话，测一下酶切胶回收之后的载体和DNA片段浓度，调整连接体系的比例，比如1:3；3、T4DNA连接的温度，最佳的我觉得是16度过夜，然后室温连接2-3小时也行，4度过夜个人觉得连接效果不大好。4、T4 DNA的连接体系，10ul就很好用，感觉没必要20ul。
你是PCR扩增产物吗，也可以试试先做个TA克隆（如果是保真性酶，可能要加A），蓝白斑筛选一下，再从克隆载体上亚克隆到表达载体。
可能说的不清楚，再讨论。希望能有些帮助。
赞一下(1人) 回复此楼
4楼2010-01-21 21:41:34
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

yujiaping1

木虫 (著名写手)
引用回帖:
Originally posted by Temin2009 at 2010-1-21 21:41:
根据你的描述，1、核对载体的抗性基因、LB平板的抗性；2、有条件的话，测一下酶切胶回收之后的载体和DNA片段浓度，调整连接体系的比例，比如1:3；3、T4DNA连接的温度，最佳的我觉得是16度过夜，然后室温连接2-3小 ...

楼上看来是高手，愿意留个QQ，经常一起讨论吗？或者你加我124759083，注明小木虫
我过去、现在、将来一直都是在从事生物科学
赞一下 回复此楼
5楼2010-01-21 22:01:32
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

gaozx123

金虫 (小有名气)
★
zsm0507(金币+1): 1-23 09:17
敢问lz用的平板还是克隆转化的平板吗？检查一下你的表达质粒上是否有你的克隆载体上的抗性基因。这个一定要搞清楚。问题应该是出现在这了。
赞一下 回复此楼
6楼2010-01-22 09:01:17
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

zsm0507

金虫 (小有名气)
先谢谢楼上各位！首先我觉得抗性肯定没有搞错，再次我预试验也做的很成功，而且我做的同一批中原来有一个200bp的成功了，可是700bp的，900bp的，1500bp,2000bp的没做出来。
赞一下 回复此楼
7楼2010-01-22 10:05:21
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

towindflower

新虫 (初入文坛)
建议做阳性对照，阳性出来了再分析其他原因
赞一下 回复此楼
8楼2010-01-22 14:13:42
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
★
zsm0507(金币+1): 1-23 09:16
既然抗性什么之类的都没错
建议再检测一下感受态有没有问题，转个空质粒去看看
然后连接试试4度过夜，有可能是没连上
赞一下(1人) 回复此楼
9楼2010-01-22 14:24:47
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

skkyy88888

铜虫 (著名写手)
★
zsm0507(金币+1): 1-23 09:16
连接酶效率低了吧。要不就是感受态的问题。其他可以不用考虑了。
赞一下(1人) 回复此楼
10楼2010-01-22 21:28:21
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 zsm0507 的主题更新
121/2返回列表12下一页
普通表情 龙 兔 虎 猫 高级回复 (可上传附件)
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[基金申请] 时间戳又变了 +13 wuchongjun 2026-08-20 19/950 2026-08-21 17:21 by 紫杉醇
[基金申请] filecode，4个jtjc了 +11 ziyangfang 2026-08-19 14/700 2026-08-21 16:51 by applepetty
[基金申请] 人气不行了 +7 fansofjerry 2026-08-21 7/350 2026-08-21 14:13 by Vivilian
[基金申请] 只有每年这种时候来逛逛小木虫 +23 yaoyewhu2008 2026-08-20 25/1250 2026-08-21 12:19 by Poppy1104
[基金申请] 时间戳又变了8-15 +15 archvillain 2026-08-15 27/1350 2026-08-21 11:32 by tim76
[基金申请] 今天基金会出结果吗？20260819 +15 kkkl_v 2026-08-19 16/800 2026-08-21 11:22 by 365372687
[基金申请] 应该是下周三26日公布了吧？ +4 哈哈蛤？ 2026-08-21 4/200 2026-08-21 10:58 by Vivilian
[基金申请] 今天放榜没戏了吧 +9 yuleib84 2026-08-19 11/550 2026-08-21 10:06 by gltch
[基金申请] 基金啊基金 +4 longfie172 2026-08-20 4/200 2026-08-21 08:58 by mark mao
[基金申请] 放榜前的不淡定 40+4 snowwithsea 2026-08-19 13/650 2026-08-21 08:30 by 北京莱茵编辑
[基金申请] 估计是周四 +3 archvillain 2026-08-18 3/150 2026-08-21 01:48 by jnhyjjm
[基金申请] 今天系统多次维护，明天很可能放榜！ +10 zju2000 2026-08-16 11/550 2026-08-20 20:02 by cl479861084
[基金申请] 时间戳变了，能看出什么问题？ +18 基诺咪客 2026-08-17 23/1150 2026-08-20 17:19 by Godzela
[基金申请] 重要消息，中午系统在维护 +11 yuleib84 2026-08-18 12/600 2026-08-20 11:09 by xskun
[教师之家] 为什么余额宝的年化利率越来越低？主要原因有哪些？ +5 瞬息宇宙 2026-08-15 5/250 2026-08-19 20:23 by super2002521
[基金申请] 今天放榜吗？ +14 布布和一二 2026-08-19 15/750 2026-08-19 18:07 by gltch
[基金申请] 2027广东省杰青 +4 奶牛小黑 2026-08-15 10/500 2026-08-19 11:02 by wanfengnew
[基金申请] 朋友圈看到的 +6 wangzilk 2026-08-18 8/400 2026-08-19 10:55 by Haru815
[基金申请] 今天维护系统维护 祝所有人 高中 +8 gjjjzhong 2026-08-18 9/450 2026-08-18 13:01 by 家与远方
[基金申请] 93BebMhtakh前后11位开头都是大写 +4 且听虎啸 2026-08-17 5/250 2026-08-18 00:49 by 蔡棒棒菂
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭