24小时热门版块排行榜    

查看: 1122  |  回复: 11
当前主题已经存档。
当前只显示满足指定条件的回帖,点击这里查看本话题的所有回帖

zsm0507

金虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】双酶切,连接转化问题,急!

我构建表达载体,双酶切连接转化后不长阳性克隆,一个菌都不长,我重复了好多次了,酶切回收我跑电泳看了,PCR片段和载体差不多亮,浓度不是很浓但也可以,感受态也是别人用的可以我才用的,可是就是不长菌,就算长一两个菌也是假阳性,不知道则么回事,快愁死了,眼看快毕业了,也快放假了,郁闷呀,着急呀,请大家帮帮我吧!谢了
回复此楼
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

zsm0507

金虫 (小有名气)

先谢谢楼上各位!首先我觉得抗性肯定没有搞错,再次我预试验也做的很成功,而且我做的同一批中原来有一个200bp的成功了,可是700bp的,900bp的,1500bp,2000bp的没做出来。
7楼2010-01-22 10:05:21
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 12 个回答

ideal9268

铜虫 (小有名气)

确认你表达载体的抗性,看看涂板时抗性是不是加错了?
2楼2010-01-21 21:39:12
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

fungixx

至尊木虫 (文坛精英)

优秀版主优秀版主优秀版主


zsm0507(金币+1): 1-23 09:17
是不是pcr产物没有酶切开,怀疑:1保护碱基太少,2引物酶切位点合成错了。连接是pcr片段最少是质粒的三倍-------------------
几年前踏上火车那一刻都还没有意识到,从此故乡只有冬夏,再无春秋
3楼2010-01-21 21:40:22
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

Temin2009

木虫 (正式写手)

★ ★
zsm0507(金币+2): 1-23 09:15
根据你的描述,1、核对载体的抗性基因、LB平板的抗性;2、有条件的话,测一下酶切胶回收之后的载体和DNA片段浓度,调整连接体系的比例,比如1:3;3、T4DNA连接的温度,最佳的我觉得是16度过夜,然后室温连接2-3小时也行,4度过夜个人觉得连接效果不大好。4、T4 DNA的连接体系,10ul就很好用,感觉没必要20ul。
你是PCR扩增产物吗,也可以试试先做个TA克隆(如果是保真性酶,可能要加A),蓝白斑筛选一下,再从克隆载体上亚克隆到表达载体。
可能说的不清楚,再讨论。希望能有些帮助。
4楼2010-01-21 21:41:34
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
普通表情 高级回复 (可上传附件)
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 一志愿华中农业071010,总分320求调剂 +5 困困困困坤坤 2026-03-20 6/300 2026-03-22 17:41 by hxsm
[考研] 324求调剂 +6 lucky呀呀呀鸭 2026-03-20 6/300 2026-03-22 16:01 by ColorlessPI
[考研] 一志愿中南大学化学学硕0703总分337求调剂 +3 niko- 2026-03-22 3/150 2026-03-22 15:15 by 杨杨杨紫
[考研] 269专硕求调剂 +6 金恩贝 2026-03-21 6/300 2026-03-22 14:31 by ColorlessPI
[考研] 一志愿070300浙大化学358分,求调剂! +3 酥酥鱼.. 2026-03-21 3/150 2026-03-22 11:31 by 杨杨杨紫
[考研] 化学调剂 +5 yzysaa 2026-03-21 5/250 2026-03-21 22:12 by peike
[考研] 材料工程专硕 348分求调剂 +3 冬辞. 2026-03-17 5/250 2026-03-21 18:47 by 学员8dgXkO
[考研] 0703化学调剂 +4 妮妮ninicgb 2026-03-21 4/200 2026-03-21 18:39 by 学员8dgXkO
[考研] 求调剂 +3 13341 2026-03-20 3/150 2026-03-21 18:28 by 学员8dgXkO
[考研] 求助 +5 梦里的无言 2026-03-21 6/300 2026-03-21 17:51 by 学员8dgXkO
[考研] 313求调剂 +4 肆叁贰壹22 2026-03-19 4/200 2026-03-21 17:33 by ColorlessPI
[考研] 303求调剂 +5 睿08 2026-03-17 7/350 2026-03-21 03:11 by JourneyLucky
[考研] 083200学硕321分一志愿暨南大学求调剂 +3 innocenceF 2026-03-17 3/150 2026-03-21 02:35 by JourneyLucky
[考研] 317求调剂 +5 申子申申 2026-03-19 9/450 2026-03-20 22:26 by JourneyLucky
[考研] 350求调剂 +5 weudhdk 2026-03-19 5/250 2026-03-20 22:04 by luoyongfeng
[考研] 295复试调剂 +8 简木ChuFront 2026-03-19 8/400 2026-03-20 20:44 by zhukairuo
[考研] 085600材料与化工调剂 324分 +10 llllkkkhh 2026-03-18 12/600 2026-03-19 14:33 by llllkkkhh
[考研] 085600材料与化工求调剂 +6 绪幸与子 2026-03-17 6/300 2026-03-19 13:27 by houyaoxu
[考研] 材料专硕306英一数二 +10 z1z2z3879 2026-03-16 13/650 2026-03-18 14:20 by 007_lilei
[考研] 333求调剂 +3 文思客 2026-03-16 7/350 2026-03-16 18:21 by 文思客
信息提示
请填处理意见