24小时热门版块排行榜    

查看: 1125  |  回复: 11
当前主题已经存档。
当前只显示满足指定条件的回帖,点击这里查看本话题的所有回帖

zsm0507

金虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】双酶切,连接转化问题,急!

我构建表达载体,双酶切连接转化后不长阳性克隆,一个菌都不长,我重复了好多次了,酶切回收我跑电泳看了,PCR片段和载体差不多亮,浓度不是很浓但也可以,感受态也是别人用的可以我才用的,可是就是不长菌,就算长一两个菌也是假阳性,不知道则么回事,快愁死了,眼看快毕业了,也快放假了,郁闷呀,着急呀,请大家帮帮我吧!谢了
回复此楼
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)


zsm0507(金币+1): 1-23 09:16
既然抗性什么之类的都没错
建议再检测一下感受态有没有问题,转个空质粒去看看
然后连接试试4度过夜,有可能是没连上
9楼2010-01-22 14:24:47
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 12 个回答

ideal9268

铜虫 (小有名气)

确认你表达载体的抗性,看看涂板时抗性是不是加错了?
2楼2010-01-21 21:39:12
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

fungixx

至尊木虫 (文坛精英)

优秀版主优秀版主优秀版主


zsm0507(金币+1): 1-23 09:17
是不是pcr产物没有酶切开,怀疑:1保护碱基太少,2引物酶切位点合成错了。连接是pcr片段最少是质粒的三倍-------------------
几年前踏上火车那一刻都还没有意识到,从此故乡只有冬夏,再无春秋
3楼2010-01-21 21:40:22
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

Temin2009

木虫 (正式写手)

★ ★
zsm0507(金币+2): 1-23 09:15
根据你的描述,1、核对载体的抗性基因、LB平板的抗性;2、有条件的话,测一下酶切胶回收之后的载体和DNA片段浓度,调整连接体系的比例,比如1:3;3、T4DNA连接的温度,最佳的我觉得是16度过夜,然后室温连接2-3小时也行,4度过夜个人觉得连接效果不大好。4、T4 DNA的连接体系,10ul就很好用,感觉没必要20ul。
你是PCR扩增产物吗,也可以试试先做个TA克隆(如果是保真性酶,可能要加A),蓝白斑筛选一下,再从克隆载体上亚克隆到表达载体。
可能说的不清楚,再讨论。希望能有些帮助。
4楼2010-01-21 21:41:34
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
普通表情 高级回复 (可上传附件)
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 一志愿武理材料工程348求调剂 +5  ̄^ ̄゜汗 2026-03-19 7/350 2026-03-22 19:44 by 公瑾逍遥
[考研] 一志愿华中农业071010,总分320求调剂 +5 困困困困坤坤 2026-03-20 6/300 2026-03-22 17:41 by hxsm
[考研] 305分求调剂(食品工程) +4 Sxy112 2026-03-21 6/300 2026-03-22 15:26 by 无懈可击111
[基金申请] 山东省面上项目限额评审 +4 石瑞0426 2026-03-19 4/200 2026-03-22 08:50 by Wei_ren
[考研] 材料学硕301分求调剂 +7 Liyouyumairs 2026-03-21 7/350 2026-03-21 22:31 by peike
[考研] 333求调剂 +5 87639 2026-03-21 7/350 2026-03-21 19:31 by ColorlessPI
[考研] 材料与化工(0856)304求B区调剂 +3 邱gl 2026-03-20 7/350 2026-03-21 19:05 by 15709483992
[考研] 一志愿深大,0703化学,总分302,求调剂 +4 七月-七七 2026-03-21 4/200 2026-03-21 18:20 by 学员8dgXkO
[考研] 268求调剂 +9 简单点0 2026-03-17 9/450 2026-03-21 15:37 by lature00
[考研] 南昌大学材料专硕311分求调剂 +6 77chaselx 2026-03-20 6/300 2026-03-21 07:24 by JourneyLucky
[考研] 316求调剂 +6 梁茜雯 2026-03-19 6/300 2026-03-21 06:32 by Ecowxq666!
[考研] 一志愿山大07化学 332分 四六级已过 本科山东双非 求调剂! +3 不想理你 2026-03-16 3/150 2026-03-21 03:59 by JourneyLucky
[考研] 265求调剂 +3 Jack?k?y 2026-03-17 3/150 2026-03-21 03:17 by JourneyLucky
[考研] 288求调剂 +16 于海海海海 2026-03-19 16/800 2026-03-20 22:28 by JourneyLucky
[考研] 材料与化工专硕调剂 +7 heming3743 2026-03-16 7/350 2026-03-20 19:31 by zhukairuo
[考研] 一志愿南理工085701环境302求调剂院校 +3 葵梓卫队 2026-03-20 3/150 2026-03-20 19:28 by zhukairuo
[考研] 环境工程调剂 +9 大可digkids 2026-03-16 9/450 2026-03-20 17:38 by 醉在风里
[考研] 0703化学调剂 +4 18889395102 2026-03-18 4/200 2026-03-19 16:13 by 30660438
[考研] 有没有道铁/土木的想调剂南林,给自己招师弟中~ +3 TqlXswl 2026-03-16 7/350 2026-03-17 15:23 by TqlXswl
[考研] 333求调剂 +3 文思客 2026-03-16 7/350 2026-03-16 18:21 by 文思客
信息提示
请填处理意见