应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】双酶切，连接转化问题，急！
51/1返回列表
查看: 1449  |  回复: 11
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
当前主题已经存档。
当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖

zsm0507

金虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】双酶切，连接转化问题，急！

我构建表达载体，双酶切连接转化后不长阳性克隆，一个菌都不长，我重复了好多次了，酶切回收我跑电泳看了，PCR片段和载体差不多亮，浓度不是很浓但也可以，感受态也是别人用的可以我才用的，可是就是不长菌，就算长一两个菌也是假阳性，不知道则么回事，快愁死了，眼看快毕业了，也快放假了，郁闷呀，着急呀，请大家帮帮我吧！谢了
回复此楼

» 猜你喜欢
1楼 2010-01-21 21:28:09
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

yujiaping1

木虫 (著名写手)
引用回帖:
Originally posted by Temin2009 at 2010-1-21 21:41:
根据你的描述，1、核对载体的抗性基因、LB平板的抗性；2、有条件的话，测一下酶切胶回收之后的载体和DNA片段浓度，调整连接体系的比例，比如1:3；3、T4DNA连接的温度，最佳的我觉得是16度过夜，然后室温连接2-3小 ...

楼上看来是高手，愿意留个QQ，经常一起讨论吗？或者你加我124759083，注明小木虫
我过去、现在、将来一直都是在从事生物科学
赞一下 回复此楼
5楼2010-01-21 22:01:32
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 12 个回答

ideal9268

铜虫 (小有名气)
确认你表达载体的抗性，看看涂板时抗性是不是加错了？
赞一下 回复此楼
2楼2010-01-21 21:39:12
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

fungixx

至尊木虫 (文坛精英)

优秀版主优秀版主优秀版主
★
zsm0507(金币+1): 1-23 09:17
是不是pcr产物没有酶切开，怀疑：1保护碱基太少，2引物酶切位点合成错了。连接是pcr片段最少是质粒的三倍-------------------
赞一下 回复此楼
几年前踏上火车那一刻都还没有意识到,从此故乡只有冬夏,再无春秋
3楼2010-01-21 21:40:22
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

Temin2009

木虫 (正式写手)
★ ★
zsm0507(金币+2): 1-23 09:15
根据你的描述，1、核对载体的抗性基因、LB平板的抗性；2、有条件的话，测一下酶切胶回收之后的载体和DNA片段浓度，调整连接体系的比例，比如1:3；3、T4DNA连接的温度，最佳的我觉得是16度过夜，然后室温连接2-3小时也行，4度过夜个人觉得连接效果不大好。4、T4 DNA的连接体系，10ul就很好用，感觉没必要20ul。
你是PCR扩增产物吗，也可以试试先做个TA克隆（如果是保真性酶，可能要加A），蓝白斑筛选一下，再从克隆载体上亚克隆到表达载体。
可能说的不清楚，再讨论。希望能有些帮助。
赞一下(1人) 回复此楼
4楼2010-01-21 21:41:34
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 12 个回答
普通表情 龙 兔 虎 猫 高级回复 (可上传附件)
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[公派出国] 售SCI一区T0P文章，我:8O.55.1.O.54,科目全,可伽急 +4 FChKX8meu1ds 2026-11-09 8/400 2026-11-11 01:49 by Z7qfCsdIiD1T
[论文投稿] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O.5.4,科目全,可+急 +4 cqv1zKnzd7hr 2026-11-09 6/300 2026-11-11 01:21 by Z7qfCsdIiD1T
[教师之家] 售SCI一区T0P文章，我:8.O55.1.O.54,科目全,可十急 +4 zSbvVX9JFl9J 2026-11-09 6/300 2026-11-11 01:02 by Z7qfCsdIiD1T
[考博] 售SCI一区T0P文章，我:8O.55.1.O.5.4,科目齐全,可+急 +3 FChKX8meu1ds 2026-11-09 4/200 2026-11-10 22:47 by Z7qfCsdIiD1T
[硕博家园] 售SCI一区T0P文章，我:8.O55.1.O.54,科目全,可十急 +3 FChKX8meu1ds 2026-11-09 4/200 2026-11-10 20:51 by Z7qfCsdIiD1T
[教师之家] 售SCI一区T0P文章，我:8.O55.1.O.54,科目全,可十急 +4 cqv1zKnzd7hr 2026-11-09 5/250 2026-11-10 20:45 by Z7qfCsdIiD1T
[考研] 售SCI一区文章，我:8O5.5.1.O5.4,科目全,可伽急 +4 cqv1zKnzd7hr 2026-11-09 5/250 2026-11-10 20:18 by Z7qfCsdIiD1T
[论文投稿] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O.5.4,科目全,可+急 +4 cqv1zKnzd7hr 2026-11-09 5/250 2026-11-10 20:12 by Z7qfCsdIiD1T
[硕博家园] 售SCI-T0P文章，我:8O.5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +3 cqv1zKnzd7hr 2026-11-09 4/200 2026-11-10 20:07 by Z7qfCsdIiD1T
[硕博家园] 售SCI文章，我:8O.5.5.1O.54,科目全,可十急 +4 0TEMgxdT1eIw 2026-11-09 5/250 2026-11-10 19:45 by Z7qfCsdIiD1T
[公派出国] 售SCI-T0P文章，我:8O.5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +4 zSbvVX9JFl9J 2026-11-09 4/200 2026-11-10 19:39 by Z7qfCsdIiD1T
[教师之家] 延安大学回应“副教授留绝笔信”：确已离世，正核实举报内容 +4 yexuqing 2026-11-04 6/300 2026-11-10 11:13 by susizheng
[考博] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O54,科目全,可伽急 +5 kvewwGtKktqB 2026-11-04 12/600 2026-11-09 13:26 by Equinoxhua
[考博] 售SCI文章，我:8O.5.5.1O.54,科目全,可十急 +5 5sJFDKp2kwuI 2026-11-06 15/750 2026-11-09 11:41 by GwrQVVR6Oenx
[考研] 售SCI一区T0P文章，我:8O.55.1.O.54,科目全,可伽急 +3 5sJFDKp2kwuI 2026-11-06 12/600 2026-11-09 06:32 by l48hFd8Nwae2
[教师之家] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可+急 +4 5sJFDKp2kwuI 2026-11-06 8/400 2026-11-08 23:01 by l48hFd8Nwae2
[教师之家] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O.5.4,科目全,可+急 +5 5sJFDKp2kwuI 2026-11-06 9/450 2026-11-08 22:46 by l48hFd8Nwae2
[公派出国] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可+急 +5 ttH3f1oA6ace 2026-11-04 10/500 2026-11-06 16:12 by 5sJFDKp2kwuI
[硕博家园] 售SCI一区文章，我:8O5.5.1.O5.4,科目全,可伽急 +4 ttH3f1oA6ace 2026-11-04 11/550 2026-11-06 16:10 by 5sJFDKp2kwuI
[硕博家园] 售SCI一区T0P文章，我:8.O55.1.O.54,科目全,可十急 +4 hNpp4Y2CGvSC 2026-11-04 12/600 2026-11-06 01:53 by qL1cU46YIdK0
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭