24小时热门版块排行榜    

Znn3bq.jpeg
查看: 1150  |  回复: 11
当前主题已经存档。
当前只显示满足指定条件的回帖,点击这里查看本话题的所有回帖

zsm0507

金虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】双酶切,连接转化问题,急!

我构建表达载体,双酶切连接转化后不长阳性克隆,一个菌都不长,我重复了好多次了,酶切回收我跑电泳看了,PCR片段和载体差不多亮,浓度不是很浓但也可以,感受态也是别人用的可以我才用的,可是就是不长菌,就算长一两个菌也是假阳性,不知道则么回事,快愁死了,眼看快毕业了,也快放假了,郁闷呀,着急呀,请大家帮帮我吧!谢了
回复此楼
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

yujiaping1

木虫 (著名写手)

引用回帖:
Originally posted by Temin2009 at 2010-1-21 21:41:
根据你的描述,1、核对载体的抗性基因、LB平板的抗性;2、有条件的话,测一下酶切胶回收之后的载体和DNA片段浓度,调整连接体系的比例,比如1:3;3、T4DNA连接的温度,最佳的我觉得是16度过夜,然后室温连接2-3小 ...

楼上看来是高手,愿意留个QQ,经常一起讨论吗?或者你加我124759083,注明小木虫
我过去、现在、将来一直都是在从事生物科学
5楼2010-01-21 22:01:32
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 12 个回答

ideal9268

铜虫 (小有名气)

确认你表达载体的抗性,看看涂板时抗性是不是加错了?
2楼2010-01-21 21:39:12
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

fungixx

至尊木虫 (文坛精英)

优秀版主优秀版主优秀版主


zsm0507(金币+1): 1-23 09:17
是不是pcr产物没有酶切开,怀疑:1保护碱基太少,2引物酶切位点合成错了。连接是pcr片段最少是质粒的三倍-------------------
几年前踏上火车那一刻都还没有意识到,从此故乡只有冬夏,再无春秋
3楼2010-01-21 21:40:22
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

Temin2009

木虫 (正式写手)

★ ★
zsm0507(金币+2): 1-23 09:15
根据你的描述,1、核对载体的抗性基因、LB平板的抗性;2、有条件的话,测一下酶切胶回收之后的载体和DNA片段浓度,调整连接体系的比例,比如1:3;3、T4DNA连接的温度,最佳的我觉得是16度过夜,然后室温连接2-3小时也行,4度过夜个人觉得连接效果不大好。4、T4 DNA的连接体系,10ul就很好用,感觉没必要20ul。
你是PCR扩增产物吗,也可以试试先做个TA克隆(如果是保真性酶,可能要加A),蓝白斑筛选一下,再从克隆载体上亚克隆到表达载体。
可能说的不清楚,再讨论。希望能有些帮助。
4楼2010-01-21 21:41:34
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
普通表情 高级回复 (可上传附件)
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 电气专硕320求调剂 +6 小麻子111 2026-04-10 6/300 2026-04-12 10:54 by lemon6009
[考研] 307求调剂 +10 tzq94092 2026-04-10 10/500 2026-04-12 08:18 by wise999
[考研] 化学工程调剂289 +44 yang婷 2026-04-07 50/2500 2026-04-12 02:36 by 秋豆菜芽
[考研] 化工调剂求导师收留!一志愿失利,踏实肯干,有植物提取科研经历 +20 yzyzx 2026-04-09 21/1050 2026-04-12 00:12 by 小小小小啦啦啦
[考研] 288求调剂,一志愿华南理工大学071005 +18 ioodiiij 2026-04-08 18/900 2026-04-11 20:25 by liyun12321
[考研] 283求调剂 086004考英二数二 +17 那个噜子 2026-04-10 18/900 2026-04-11 16:27 by 明月此时有
[考研] 化学308分求调剂 +22 你好明天你好 2026-04-07 24/1200 2026-04-11 11:14 by ChemPharm
[考研] 农学0904 312求调剂 +6 Say Never 2026-04-10 6/300 2026-04-11 10:33 by wwj2530616
[考研] 284求调剂 +19 梵@@ 2026-04-06 21/1050 2026-04-10 21:12 by zhouxiaoyu
[考研] 中科院总分315求调剂 +8 lallalh 2026-04-09 8/400 2026-04-10 19:30 by dick_runner
[考研] 362求调剂 +10 我要考大 2026-04-06 14/700 2026-04-10 17:00 by luoyongfeng
[考研] 0856专硕求调剂 希望是a区院校 +21 好好休息好不好 2026-04-09 24/1200 2026-04-10 16:58 by luoyongfeng
[考研] 一志愿沪9,326生物学求相关专业调剂 +4 刘墨墨 2026-04-09 4/200 2026-04-10 12:07 by pengliang8036
[考研] 0703化学求调剂 +21 不知名的小卅 2026-04-08 21/1050 2026-04-09 18:55 by l_paradox
[考研] 化学工程与技术专业一志愿哈工程 291分B区 国家级大创负责人 有一作论文 +13 Emmy~ 2026-04-09 13/650 2026-04-09 14:47 by only周
[考研] 086004 求调剂 309 +7 Yin DY 2026-04-08 7/350 2026-04-09 13:59 by Delta2012
[考研] 353求调剂 +8 晴空万里air 2026-04-07 8/400 2026-04-09 00:18 by GouQ
[考研] 软件工程求调剂22软工296分求调剂,接受跨调 +4 yangchen2017 2026-04-08 5/250 2026-04-08 21:56 by 土木硕士招生
[考研] 一志愿南京航空航天大学 材料与化工329分求调剂 +11 Mr. Z 2026-04-05 12/600 2026-04-08 16:15 by luoyongfeng
[考研] 考研调剂生寻找导师 +3 顾瞻考研啊 2026-04-05 3/150 2026-04-05 18:18 by 啵啵啵0119
信息提示
请填处理意见