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刘超_2009

新虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】关于酶切回收问题

做了次质粒(pET-28a)的双酶切(37°过夜),采用胶回收的步骤回收酶切质粒跑电泳发现没有任何条带(完整质粒跑胶时有较暗的条带)。问题出在哪儿了?怎么会连什么条带都没有呢?难道是没洗脱下来或是吸附柱损毁直接从废液中丢弃了?
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gxsulong

至尊木虫 (著名写手)


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第一,可能你在做酶切的时候污染了核酸酶,降解掉了。
第二,回收的时候没洗脱下来,现在一般的试剂盒都要求洗脱液加热到65度。不过按照现在试剂盒的质量来说,第二个原因的可能性很少。
霉菌
2楼2010-01-21 10:50:23
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yujianxue

新虫 (初入文坛)


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可能是本来pcr产物条带就不亮,加上回收效率低,或者胶背景太亮,本身量少,所以酶切后无条带显示。
3楼2010-01-21 11:00:16
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刘超_2009

新虫 (小有名气)

引用回帖:
Originally posted by yujianxue at 2010-1-21 11:00:
可能是本来pcr产物条带就不亮,加上回收效率低,或者胶背景太亮,本身量少,所以酶切后无条带显示。

有道理,我再重复一遍吧,把质粒的量加大些做做
4楼2010-01-21 11:45:24
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smallcat227

木虫 (著名写手)


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量太少了吧,回收不到也正常,下次加大量吧,可以溶解在少一点的Eluent里
5楼2010-01-21 11:58:23
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susizheng

木虫 (著名写手)

我們是糖 甜到憂傷


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你用是什么样的试剂盒,有些试剂盒虽然标明可以回收10kb的片段,其实3-4kb的就已经超出回收极限了,回收载体推荐Fermentas或者omega的盒子。实在不行,乙醇沉淀下吧。
Thank-you,so-blue.
6楼2010-01-21 12:19:23
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