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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】关于酶切回收问题
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刘超_2009

新虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】关于酶切回收问题

做了次质粒（pET-28a）的双酶切（37°过夜），采用胶回收的步骤回收酶切质粒跑电泳发现没有任何条带（完整质粒跑胶时有较暗的条带）。问题出在哪儿了?怎么会连什么条带都没有呢？难道是没洗脱下来或是吸附柱损毁直接从废液中丢弃了？
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1楼 2010-01-21 10:28:31
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gxsulong

至尊木虫 (著名写手)
★
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第一，可能你在做酶切的时候污染了核酸酶，降解掉了。
第二，回收的时候没洗脱下来，现在一般的试剂盒都要求洗脱液加热到65度。不过按照现在试剂盒的质量来说，第二个原因的可能性很少。
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霉菌
2楼2010-01-21 10:50:23
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yujianxue

新虫 (初入文坛)
★
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可能是本来pcr产物条带就不亮，加上回收效率低，或者胶背景太亮，本身量少，所以酶切后无条带显示。
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3楼2010-01-21 11:00:16
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刘超_2009

新虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by yujianxue at 2010-1-21 11:00:
可能是本来pcr产物条带就不亮，加上回收效率低，或者胶背景太亮，本身量少，所以酶切后无条带显示。

有道理，我再重复一遍吧，把质粒的量加大些做做
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4楼2010-01-21 11:45:24
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smallcat227

木虫 (著名写手)
★
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量太少了吧，回收不到也正常，下次加大量吧，可以溶解在少一点的Eluent里
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5楼2010-01-21 11:58:23
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susizheng

木虫 (著名写手)

我們是糖 甜到憂傷
★
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你用是什么样的试剂盒，有些试剂盒虽然标明可以回收10kb的片段，其实3-4kb的就已经超出回收极限了，回收载体推荐Fermentas或者omega的盒子。实在不行，乙醇沉淀下吧。
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Thank-you，so-blue.
6楼2010-01-21 12:19:23
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