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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】pcr问题
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chchy2085

木虫 (正式写手)

[交流] 【求助/交流】pcr问题

各位虫友：好，最近比较烦，遇到pcr问题了，想来讨教，我的一个
上游引物：5'-GTCGAATTCATGGACAGGCTTACTTCCTCATTG-3',
下游引物：5‘-TCCGCCAGAGCCTCCGCCTCCGCTACCTCCGCCGCCGGCTGAGGAGACGGTGACTGAGGT-3'
请高手指点，我的退火温度该选择多少比较合适，我梯度pcr已经做了，从54到66度都没有目的条带（500bp），还有体系该怎么弄，我原来的体系是25微升的，再次恳求各位高手指点。谢谢！
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1楼 2010-01-17 22:12:31
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brightfuture01

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chchy2085(金币+5,VIP+0): 1-17 22:33
1949stone(金币+3,VIP+0): 1-17 23:24
我帮你分析下，按照Tm=2（A+T)+4(G+C)来算：
你的上游引物的Tm为2（7+11）+4(7+8)=96     33 bp
你的下游引物的Tm为2（8+9）+4(24+19)=206   60bp
虽然只是一个公式的运算，但是至少可以说明你的这对引物在延伸温度72度以下是没有扩增能力的。连个引物的退火温度相差太多太多。
你做什么梯度都没有用。做多大体系都没用。
可能是我孤陋寡闻，但是我真是第一次看见60bp的引物，你可以算算60的4次方是多少。用的着这么这么如此的特异么？
我的建议：楼主多学习下引物设计的原则，重新设计引物
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The world is a fine place and worth fighting for. I agree with the second part.
2楼2010-01-17 22:27:48
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chchy2085

木虫 (正式写手)
你好，首先谢谢你，下游引物只有后面的24个碱基是结合到我的目的基因上的，前面的大部分是作为连接肽的一部分，用于以后做TP-PCR的，请求在给些建议
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3楼2010-01-17 22:33:15
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brightfuture01

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1949stone(金币+3,VIP+0): 1-17 23:24
chchy2085(金币+3,VIP+0): 1-18 09:35
首先，上游引物的Tm还是偏高，所以需要砍掉一部分，最好能在18-22bp的范围内。
再者，下游引物的核心序列24bp也砍掉一些，使得和上游引物的Tm相近。
最后，我用DNAman分析了下，你的下游引物的前面36bp会折回来和你的核心引物24bp的序列互补产生三个大于三碱基的互补序列。这个非常致命。
你再考虑考虑还有其他方法往里面添加你的这段肽序列么？
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4楼2010-01-17 22:46:09
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brightfuture01

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1949stone(金币+2,VIP+0): 1-17 23:24
chchy2085(金币+3,VIP+0): 1-18 09:35
你参考下DNAman 的下游引物互补性结果：
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5楼2010-01-17 23:09:35
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biogefart

木虫 (著名写手)
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chchy2085(金币+4,VIP+0): 1-18 09:35
1949stone(金币+1,VIP+0): 1-18 09:58
讨论的非常热烈，也非常深入，可是为什么不把一次的PCR拆成两次或者三次呢？就没有这些挠头的问题了
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闹太套
6楼2010-01-17 23:23:58
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chchy2085

木虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by biogefart at 2010-1-17 23:23:
讨论的非常热烈，也非常深入，可是为什么不把一次的PCR拆成两次或者三次呢？就没有这些挠头的问题了

我有些不明白，请这位高手多给点提示，不胜感激
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7楼2010-01-18 09:34:51
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biogefart

木虫 (著名写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
简单来说，就是用三个不断延长的引物进行三次PCR，可以降低引物的Tm值和互补性
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闹太套
8楼2010-01-18 12:34:03
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