应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

Znn3bq.jpeg
小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】pcr问题
51/1返回列表
查看: 473  |  回复: 7
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
当前主题已经存档。
当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖

chchy2085

木虫 (正式写手)

[交流] 【求助/交流】pcr问题

各位虫友：好，最近比较烦，遇到pcr问题了，想来讨教，我的一个
上游引物：5'-GTCGAATTCATGGACAGGCTTACTTCCTCATTG-3',
下游引物：5‘-TCCGCCAGAGCCTCCGCCTCCGCTACCTCCGCCGCCGGCTGAGGAGACGGTGACTGAGGT-3'
请高手指点，我的退火温度该选择多少比较合适，我梯度pcr已经做了，从54到66度都没有目的条带（500bp），还有体系该怎么弄，我原来的体系是25微升的，再次恳求各位高手指点。谢谢！
回复此楼

» 猜你喜欢
1楼 2010-01-17 22:12:31
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

brightfuture01

木虫之王 (文坛精英)

我爱打老虎

文献杰出贡献
★ ★ ★ ★ ★ ★
1949stone(金币+3,VIP+0): 1-17 23:24
chchy2085(金币+3,VIP+0): 1-18 09:35
首先，上游引物的Tm还是偏高，所以需要砍掉一部分，最好能在18-22bp的范围内。
再者，下游引物的核心序列24bp也砍掉一些，使得和上游引物的Tm相近。
最后，我用DNAman分析了下，你的下游引物的前面36bp会折回来和你的核心引物24bp的序列互补产生三个大于三碱基的互补序列。这个非常致命。
你再考虑考虑还有其他方法往里面添加你的这段肽序列么？
赞一下(12人) 回复此楼
The world is a fine place and worth fighting for. I agree with the second part.
4楼2010-01-17 22:46:09
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 8 个回答

brightfuture01

木虫之王 (文坛精英)

我爱打老虎

文献杰出贡献
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
chchy2085(金币+5,VIP+0): 1-17 22:33
1949stone(金币+3,VIP+0): 1-17 23:24
我帮你分析下，按照Tm=2（A+T)+4(G+C)来算：
你的上游引物的Tm为2（7+11）+4(7+8)=96     33 bp
你的下游引物的Tm为2（8+9）+4(24+19)=206   60bp
虽然只是一个公式的运算，但是至少可以说明你的这对引物在延伸温度72度以下是没有扩增能力的。连个引物的退火温度相差太多太多。
你做什么梯度都没有用。做多大体系都没用。
可能是我孤陋寡闻，但是我真是第一次看见60bp的引物，你可以算算60的4次方是多少。用的着这么这么如此的特异么？
我的建议：楼主多学习下引物设计的原则，重新设计引物
赞一下(11人) 回复此楼
The world is a fine place and worth fighting for. I agree with the second part.
2楼2010-01-17 22:27:48
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

chchy2085

木虫 (正式写手)
你好，首先谢谢你，下游引物只有后面的24个碱基是结合到我的目的基因上的，前面的大部分是作为连接肽的一部分，用于以后做TP-PCR的，请求在给些建议
赞一下 回复此楼
3楼2010-01-17 22:33:15
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

brightfuture01

木虫之王 (文坛精英)

我爱打老虎

文献杰出贡献
★ ★ ★ ★ ★
1949stone(金币+2,VIP+0): 1-17 23:24
chchy2085(金币+3,VIP+0): 1-18 09:35
你参考下DNAman 的下游引物互补性结果：
赞一下(11人) 回复此楼
The world is a fine place and worth fighting for. I agree with the second part.
5楼2010-01-17 23:09:35
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 8 个回答
普通表情 龙 兔 虎 猫 高级回复 (可上传附件)
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 085410 273求调剂 +7 X1999 2026-04-09 7/350 2026-04-11 21:13 by 蓝云思雨
[考研] 283求调剂 086004考英二数二 +17 那个噜子 2026-04-10 18/900 2026-04-11 16:27 by 明月此时有
[考研] 化工求调剂！ +35 RichLi_ 2026-04-06 35/1750 2026-04-11 11:02 by zhq0425
[材料工程] 材料调剂推荐 +8 蛋糕x2 2026-04-07 8/400 2026-04-10 23:13 by Ftglcn90
[考研] 生物学308分求调剂（一志愿华东师大）做过分子实验 +8 相信必会光芒万� 2026-04-07 9/450 2026-04-10 21:03 by zhouxiaoyu
[考研] 336材料与化工085600求调剂 +21 水星记infp 2026-04-05 24/1200 2026-04-10 15:28 by luoyongfeng
[考研] 一志愿中南大学物理学，英一66，求调剂 +4 长烟旖旎 2026-04-08 5/250 2026-04-10 10:31 by 颖果儿
[考研] 367求调剂 +10 hffQAQ 2026-04-09 10/500 2026-04-09 18:06 by lijunpoly
[考研] 274求调剂 +5 山阿蔓 2026-04-07 5/250 2026-04-09 15:28 by 18828373951
[考研] 一志愿吉大化学327求调剂 +12 王王白石 2026-04-06 13/650 2026-04-08 16:05 by luoyongfeng
[考研] 求调剂，现在还能填的 +3 上岸小莹加油 2026-04-08 3/150 2026-04-08 14:30 by zhq0425
[考研] 336求调剂，一志愿中科大 +9 墨彧 yuyu 2026-04-06 9/450 2026-04-08 11:24 by 想读书的菌菌
[考研] 259求调剂 +5 就爱吃土豆呀呀 2026-04-07 5/250 2026-04-07 22:40 by JourneyLucky
[考博] 博士申请 +3 IQwQl 2026-04-05 3/150 2026-04-07 20:31 by greychen00
[考研] 22408 调剂材料 +7 我叫ez 2026-04-06 8/400 2026-04-07 17:12 by 蓝云思雨
[考研] 生物调剂 +5 橙子橙子橙子啊 2026-04-05 9/450 2026-04-07 15:31 by 上岸快快
[考研] 软工学硕299求调剂 +6 useryy 2026-04-07 6/300 2026-04-07 09:50 by vgtyfty
[考研] 求调剂 +7 张.1 2026-04-05 7/350 2026-04-05 20:40 by 啵啵啵0119
[考研] 工科277分求调剂材料 +8 上了上了上哦 2026-04-05 9/450 2026-04-05 13:05 by wwytracy
[考研] 272求调剂 +4 电气李 2026-04-05 4/200 2026-04-05 10:41 by lbsjt
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭