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【求助/交流】pcr问题
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各位虫友：好，最近比较烦，遇到pcr问题了，想来讨教，我的一个 上游引物：5'-GTCGAATTCATGGACAGGCTTACTTCCTCATTG-3', 下游引物：5‘-TCCGCCAGAGCCTCCGCCTCCGCTACCTCCGCCGCCGGCTGAGGAGACGGTGACTGAGGT-3' 请高手指点，我的退火温度该选择多少比较合适，我梯度pcr已经做了，从54到66度都没有目的条带（500bp），还有体系该怎么弄，我原来的体系是25微升的，再次恳求各位高手指点。谢谢！ |
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brightfuture01
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5楼2010-01-17 23:09:35
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我帮你分析下，按照Tm=2（A+T)+4(G+C)来算： 你的上游引物的Tm为2（7+11）+4(7+8)=96 33 bp 你的下游引物的Tm为2（8+9）+4(24+19)=206 60bp 虽然只是一个公式的运算，但是至少可以说明你的这对引物在延伸温度72度以下是没有扩增能力的。连个引物的退火温度相差太多太多。 你做什么梯度都没有用。做多大体系都没用。 可能是我孤陋寡闻，但是我真是第一次看见60bp的引物，你可以算算60的4次方是多少。用的着这么这么如此的特异么？ 我的建议：楼主多学习下引物设计的原则，重新设计引物 |
2楼2010-01-17 22:27:48
3楼2010-01-17 22:33:15
brightfuture01
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