应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】DNase 1酶切DNA形成片段体系和方法
181/2返回列表12下一页
查看: 1346  |  回复: 17
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
当前主题已经存档。

姜大磊

木虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】DNase 1酶切DNA形成片段体系和方法

我做的是回收DNA酶切小片段，用的是DNase酶切，但是几次下来跑电泳都没有出来小片段，一点条带都没有，酶切体系是（模版，buffer（带有镁离子），DNase 1  DD水）
请高手指教，感激万分
回复此楼

» 猜你喜欢
Nevergiveup,neverslowdown;Nevergrowold,nevereverdieyoung......
1楼 2010-01-16 10:37:52
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

brightfuture01

木虫之王 (文坛精英)

我爱打老虎

文献杰出贡献
★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
1949stone(金币+2,VIP+0): 1-16 12:34
DNase酶很强的，要摸索一下酶的用量。还有酶切时间。切的时间长了就全切成十几bp大小了。跑电泳的时候要用高浓度的胶，否则时间稍微一长就全跑出去了。
赞一下(11人) 回复此楼
The world is a fine place and worth fighting for. I agree with the second part.
2楼2010-01-16 10:57:43
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

沙中清泉

木虫 (正式写手)
那个酶太厉害了
回复此楼
3楼2010-01-16 14:50:43
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

姜大磊

木虫 (小有名气)

请指教

引用回帖:
Originally posted by brightfuture01 at 2010-1-16 10:57:
DNase酶很强的，要摸索一下酶的用量。还有酶切时间。切的时间长了就全切成十几bp大小了。跑电泳的时候要用高浓度的胶，否则时间稍微一长就全跑出去了。

大哥你做过这个酶的酶切吗？？？能不能说一下你的酶切体系和时间把握以及电泳啊。。十分感谢、
赞一下 回复此楼
Nevergiveup,neverslowdown;Nevergrowold,nevereverdieyoung......
4楼2010-01-17 21:23:53
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

brightfuture01

木虫之王 (文坛精英)

我爱打老虎

文献杰出贡献
★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
1949stone(金币+1,VIP+0): 1-17 23:50
酶切体系用100-200ul的，Takara的酶，取1ul，稀释100倍，然后在200ul体系中加8ul稀释物。酶切10ug左右的DNA，时间你要自己摸索下，5min取个梯度，取到20min。

好运。
赞一下(11人) 回复此楼
The world is a fine place and worth fighting for. I agree with the second part.
5楼2010-01-17 22:53:15
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

brightfuture01

木虫之王 (文坛精英)

我爱打老虎

文献杰出贡献
1949stone(金币+0,VIP+0):重复了 1-17 23:50
酶切体系用100-200ul的，Takara的酶，取1ul，稀释100倍，然后在200ul体系中加8ul稀释物。酶切10ug左右的DNA，时间你要自己摸索下，5min取个梯度，取到20min。

好运。
赞一下(10人) 回复此楼
The world is a fine place and worth fighting for. I agree with the second part.
6楼2010-01-17 22:53:40
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

brightfuture01

木虫之王 (文坛精英)

我爱打老虎

文献杰出贡献
★
1949stone(金币+1,VIP+0): 1-17 23:50
对了，电泳要用2%的胶，跑的时间不要太长20min就好。
赞一下(10人) 回复此楼
The world is a fine place and worth fighting for. I agree with the second part.
7楼2010-01-17 22:54:37
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

姜大磊

木虫 (小有名气)

DNase 1酶切

我今天照你的说法做了一次还是没有结果，电泳一条带没有。我把回收回来的DNA按照如下体系做的，把你说的倍数缩小的一倍。我用的也是Takara的酶。百分之二的凝胶，20分钟。5分钟一个梯度。65度水浴使酶失活。 大哥能不能具体点说说的你方法啊？ 太谢谢你了。
赞一下 回复此楼
Nevergiveup,neverslowdown;Nevergrowold,nevereverdieyoung......
8楼2010-01-18 17:40:57
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

brightfuture01

木虫之王 (文坛精英)

我爱打老虎

文献杰出贡献
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
引用回帖:
Originally posted by 姜大磊 at 2010-1-18 17:40:
我今天照你的说法做了一次还是没有结果，电泳一条带没有。我把回收回来的DNA按照如下体系做的，把你说的倍数缩小的一倍。我用的也是Takara的酶。百分之二的凝胶，20分钟。5分钟一个梯度。65度水浴使酶失活。 大哥 ...

不好意思，忘了说酶切温度了。

要在16度酶切，酶最后再加，加酶之前将体系放在16度。

最后热失活要马上放于95度失活15min，可以用PCR仪提前加热到95度，一旦酶

切时间到了，马上转移。在失活之前可以往酶切体系中加入10mM终浓度的

EDTA.
赞一下(1人) 回复此楼
The world is a fine place and worth fighting for. I agree with the second part.
9楼2010-01-18 22:40:22
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

姜大磊

木虫 (小有名气)

请指教

引用回帖:
Originally posted by brightfuture01 at 2010-1-18 22:40:




不好意思，忘了说酶切温度了。

要在16度酶切，酶最后再加，加酶之前将体系放在16度。

最后热失活要马上放于95度失活15min，可以用PCR仪提前加热到95度，一旦酶

切时间到了，马上转移。在 ...

Takara的DNase1说明书上说有镁离子的时候随机产生切口，锰离子存在的时候能同时切断DNA，产生片段。
我昨天和今天做了对照。
50微升的体系：2 微升DNase1，1微升DNA模版，5微升buffer，10微升EDTA，32微升DD水。
另外一组是:再加上5微升的氯化锰溶液。
酶都是稀释了10倍。16度酶切，5分钟的梯度。我觉得95度失活会破坏DNA，我就在80度里15分钟，因为PCR的时候94度就能使DNA变性。有关DNase 1说明上也说80度就行。 百分之二的凝胶，20分钟，但是还是没有条带，一条都没有。太不应该了。 请大哥再指教一下、谢谢。
赞一下 回复此楼
Nevergiveup,neverslowdown;Nevergrowold,nevereverdieyoung......
10楼2010-01-20 14:14:40
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 姜大磊 的主题更新
181/2返回列表12下一页
普通表情 龙 兔 虎 猫 高级回复 (可上传附件)
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭