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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】DNase 1酶切DNA形成片段体系和方法
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姜大磊

木虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】DNase 1酶切DNA形成片段体系和方法

我做的是回收DNA酶切小片段，用的是DNase酶切，但是几次下来跑电泳都没有出来小片段，一点条带都没有，酶切体系是（模版，buffer（带有镁离子），DNase 1  DD水）
请高手指教，感激万分
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1楼2010-01-16 10:37:52
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brightfuture01

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1949stone(金币+2,VIP+0): 1-16 12:34
DNase酶很强的，要摸索一下酶的用量。还有酶切时间。切的时间长了就全切成十几bp大小了。跑电泳的时候要用高浓度的胶，否则时间稍微一长就全跑出去了。
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The world is a fine place and worth fighting for. I agree with the second part.
2楼2010-01-16 10:57:43
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沙中清泉

木虫 (正式写手)
那个酶太厉害了
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3楼2010-01-16 14:50:43
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姜大磊

木虫 (小有名气)

请指教

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Originally posted by brightfuture01 at 2010-1-16 10:57:
DNase酶很强的，要摸索一下酶的用量。还有酶切时间。切的时间长了就全切成十几bp大小了。跑电泳的时候要用高浓度的胶，否则时间稍微一长就全跑出去了。

大哥你做过这个酶的酶切吗？？？能不能说一下你的酶切体系和时间把握以及电泳啊。。十分感谢、
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4楼2010-01-17 21:23:53
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brightfuture01

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1949stone(金币+1,VIP+0): 1-17 23:50
酶切体系用100-200ul的，Takara的酶，取1ul，稀释100倍，然后在200ul体系中加8ul稀释物。酶切10ug左右的DNA，时间你要自己摸索下，5min取个梯度，取到20min。

好运。
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5楼2010-01-17 22:53:15
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brightfuture01

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酶切体系用100-200ul的，Takara的酶，取1ul，稀释100倍，然后在200ul体系中加8ul稀释物。酶切10ug左右的DNA，时间你要自己摸索下，5min取个梯度，取到20min。

好运。
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6楼2010-01-17 22:53:40
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对了，电泳要用2%的胶，跑的时间不要太长20min就好。
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7楼2010-01-17 22:54:37
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姜大磊

木虫 (小有名气)

DNase 1酶切

我今天照你的说法做了一次还是没有结果，电泳一条带没有。我把回收回来的DNA按照如下体系做的，把你说的倍数缩小的一倍。我用的也是Takara的酶。百分之二的凝胶，20分钟。5分钟一个梯度。65度水浴使酶失活。 大哥能不能具体点说说的你方法啊？ 太谢谢你了。
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8楼2010-01-18 17:40:57
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Originally posted by 姜大磊 at 2010-1-18 17:40:
我今天照你的说法做了一次还是没有结果，电泳一条带没有。我把回收回来的DNA按照如下体系做的，把你说的倍数缩小的一倍。我用的也是Takara的酶。百分之二的凝胶，20分钟。5分钟一个梯度。65度水浴使酶失活。 大哥 ...

不好意思，忘了说酶切温度了。

要在16度酶切，酶最后再加，加酶之前将体系放在16度。

最后热失活要马上放于95度失活15min，可以用PCR仪提前加热到95度，一旦酶

切时间到了，马上转移。在失活之前可以往酶切体系中加入10mM终浓度的

EDTA.
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9楼2010-01-18 22:40:22
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姜大磊

木虫 (小有名气)

请指教

引用回帖:
Originally posted by brightfuture01 at 2010-1-18 22:40:




不好意思，忘了说酶切温度了。

要在16度酶切，酶最后再加，加酶之前将体系放在16度。

最后热失活要马上放于95度失活15min，可以用PCR仪提前加热到95度，一旦酶

切时间到了，马上转移。在 ...

Takara的DNase1说明书上说有镁离子的时候随机产生切口，锰离子存在的时候能同时切断DNA，产生片段。
我昨天和今天做了对照。
50微升的体系：2 微升DNase1，1微升DNA模版，5微升buffer，10微升EDTA，32微升DD水。
另外一组是:再加上5微升的氯化锰溶液。
酶都是稀释了10倍。16度酶切，5分钟的梯度。我觉得95度失活会破坏DNA，我就在80度里15分钟，因为PCR的时候94度就能使DNA变性。有关DNase 1说明上也说80度就行。 百分之二的凝胶，20分钟，但是还是没有条带，一条都没有。太不应该了。 请大哥再指教一下、谢谢。
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10楼2010-01-20 14:14:40
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