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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】DNase 1酶切DNA形成片段体系和方法
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姜大磊

木虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】DNase 1酶切DNA形成片段体系和方法

我做的是回收DNA酶切小片段，用的是DNase酶切，但是几次下来跑电泳都没有出来小片段，一点条带都没有，酶切体系是（模版，buffer（带有镁离子），DNase 1  DD水）
请高手指教，感激万分
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1楼 2010-01-16 10:37:52
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brightfuture01

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引用回帖:
Originally posted by 姜大磊 at 2010-1-18 17:40:
我今天照你的说法做了一次还是没有结果，电泳一条带没有。我把回收回来的DNA按照如下体系做的，把你说的倍数缩小的一倍。我用的也是Takara的酶。百分之二的凝胶，20分钟。5分钟一个梯度。65度水浴使酶失活。 大哥 ...

不好意思，忘了说酶切温度了。

要在16度酶切，酶最后再加，加酶之前将体系放在16度。

最后热失活要马上放于95度失活15min，可以用PCR仪提前加热到95度，一旦酶

切时间到了，马上转移。在失活之前可以往酶切体系中加入10mM终浓度的

EDTA.
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9楼2010-01-18 22:40:22
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brightfuture01

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1949stone(金币+2,VIP+0): 1-16 12:34
DNase酶很强的，要摸索一下酶的用量。还有酶切时间。切的时间长了就全切成十几bp大小了。跑电泳的时候要用高浓度的胶，否则时间稍微一长就全跑出去了。
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2楼2010-01-16 10:57:43
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姜大磊

木虫 (小有名气)

请指教

引用回帖:
Originally posted by brightfuture01 at 2010-1-16 10:57:
DNase酶很强的，要摸索一下酶的用量。还有酶切时间。切的时间长了就全切成十几bp大小了。跑电泳的时候要用高浓度的胶，否则时间稍微一长就全跑出去了。

大哥你做过这个酶的酶切吗？？？能不能说一下你的酶切体系和时间把握以及电泳啊。。十分感谢、
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4楼2010-01-17 21:23:53
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brightfuture01

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1949stone(金币+1,VIP+0): 1-17 23:50
酶切体系用100-200ul的，Takara的酶，取1ul，稀释100倍，然后在200ul体系中加8ul稀释物。酶切10ug左右的DNA，时间你要自己摸索下，5min取个梯度，取到20min。

好运。
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5楼2010-01-17 22:53:15
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