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姜大磊

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[交流] 【求助/交流】DNase 1酶切DNA形成片段体系和方法

我做的是回收DNA酶切小片段，用的是DNase酶切，但是几次下来跑电泳都没有出来小片段，一点条带都没有，酶切体系是（模版，buffer（带有镁离子），DNase 1 DD水）
请高手指教，感激万分

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Nevergiveup,neverslowdown;Nevergrowold,nevereverdieyoung......

1楼2010-01-16 10:37:52

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姜大磊

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请指教

引用回帖:

Originally posted by brightfuture01 at 2010-1-18 22:40:

不好意思，忘了说酶切温度了。

要在16度酶切，酶最后再加，加酶之前将体系放在16度。

最后热失活要马上放于95度失活15min，可以用PCR仪提前加热到95度，一旦酶

切时间到了，马上转移。在 ...

Takara的DNase1说明书上说有镁离子的时候随机产生切口，锰离子存在的时候能同时切断DNA，产生片段。
我昨天和今天做了对照。
50微升的体系：2 微升DNase1，1微升DNA模版，5微升buffer，10微升EDTA，32微升DD水。
另外一组是:再加上5微升的氯化锰溶液。
酶都是稀释了10倍。16度酶切，5分钟的梯度。我觉得95度失活会破坏DNA，我就在80度里15分钟，因为PCR的时候94度就能使DNA变性。有关DNase 1说明上也说80度就行。百分之二的凝胶，20分钟，但是还是没有条带，一条都没有。太不应该了。请大哥再指教一下、谢谢。