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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】PCR整个质粒
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雨后郁金香

金虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】PCR整个质粒

RT，我需要在一个质粒里面引入我要的酶切点，所以设计了引物把整个质粒PCR下来，请问有人做过这样的吗？谈下你的经验跟感想啊，大家互相交流交流啊。。。。。
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1楼 2010-01-09 09:16:29
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boouy

银虫 (正式写手)
用得着那么做吗？
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2楼2010-01-09 09:24:23
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雨后郁金香

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by boouy at 2010-1-9 09:24:
用得着那么做吗？

恩，没有办法啊，要用这个质粒，但是质粒本身的酶切点我都不能用。。。。所以就这样做了......
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3楼2010-01-09 09:29:17
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j2

木虫 (正式写手)
★ ★
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1949stone(金币+1,VIP+0): 1-9 20:28
是不是需要先酶切成线性哦？猜想中~~~~
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修炼ｉｎｇ，当虫仙……
4楼2010-01-09 10:15:46
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
★ ★ ★ ★
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amisking(金币+3,VIP+0): 1-9 14:07
酶切后连上含有你要的酶切位点的dsOligo不就行了？
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5楼2010-01-09 10:26:27
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tianhang

新虫 (小有名气)
★ ★ ★
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amisking(金币+2,VIP+0): 1-9 14:07
对哦，同意楼上观点。你可以先把质粒提出来，用质粒现有的酶切开，再把你要用的酶切位点连接好或者pcr成一段小片段，然后再连接再这个质粒上就行了！
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6楼2010-01-09 14:01:14
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changes

木虫 (正式写手)
★
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可以自己插入需要的扩克隆位点的。整个质粒PCR扩增？很难不出错配的。
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7楼2010-01-09 17:19:21
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plantst5928

铜虫 (小有名气)
★
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当然可以，点突变的原理是类似的。你再用引物扩PCR之后需要把原来的模板降解一下，然后转化就可以了。我记得是用DMT酶消化的。
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8楼2010-01-09 20:20:23
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wangp3102

新虫 (初入文坛)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
可以
引物设计的时候加上没切位点，然后全长质粒扩增，扩增完后用T4多聚核苷酸激酶进行产物磷酸化，这样就可以用T4连接酶连接了，但是不能保证错配，因为P的片段太大，建议用高保真DNA聚合酶，如KOD-Plus酶
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9楼2010-01-20 15:27:30
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