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雨后郁金香

金虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】PCR整个质粒

RT,我需要在一个质粒里面引入我要的酶切点,所以设计了引物把整个质粒PCR下来,请问有人做过这样的吗?谈下你的经验跟感想啊,大家互相交流交流啊。。。。。
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boouy

银虫 (正式写手)

用得着那么做吗?
2楼2010-01-09 09:24:23
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雨后郁金香

金虫 (小有名气)

引用回帖:
Originally posted by boouy at 2010-1-9 09:24:
用得着那么做吗?

恩,没有办法啊,要用这个质粒,但是质粒本身的酶切点我都不能用。。。。所以就这样做了......
3楼2010-01-09 09:29:17
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j2

木虫 (正式写手)

★ ★
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1949stone(金币+1,VIP+0): 1-9 20:28
是不是需要先酶切成线性哦?猜想中~~~~
修炼ing,当虫仙……
4楼2010-01-09 10:15:46
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)

★ ★ ★ ★
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amisking(金币+3,VIP+0): 1-9 14:07
酶切后连上含有你要的酶切位点的dsOligo不就行了?
5楼2010-01-09 10:26:27
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tianhang

新虫 (小有名气)

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amisking(金币+2,VIP+0): 1-9 14:07
对哦,同意楼上观点。你可以先把质粒提出来,用质粒现有的酶切开,再把你要用的酶切位点连接好或者pcr成一段小片段,然后再连接再这个质粒上就行了!
6楼2010-01-09 14:01:14
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changes

木虫 (正式写手)


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可以自己插入需要的扩克隆位点的。整个质粒PCR扩增?很难不出错配的。
7楼2010-01-09 17:19:21
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plantst5928

铜虫 (小有名气)


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当然可以,点突变的原理是类似的。你再用引物扩PCR之后需要把原来的模板降解一下,然后转化就可以了。我记得是用DMT酶消化的。
8楼2010-01-09 20:20:23
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wangp3102

新虫 (初入文坛)


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可以
引物设计的时候加上没切位点,然后全长质粒扩增,扩增完后用T4多聚核苷酸激酶进行产物磷酸化,这样就可以用T4连接酶连接了,但是不能保证错配,因为P的片段太大,建议用高保真DNA聚合酶,如KOD-Plus酶
9楼2010-01-20 15:27:30
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