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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 药学 » 药理学 » 【求助】求教肝微粒体体外代谢实验问题
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gentledragon

金虫 (正式写手)

[交流] 【求助】求教肝微粒体体外代谢实验问题 已有14人参与

求教肝微粒体体外代谢实验问题：
我从sigma订购的鼠肝微粒体M9066，NADPH，按照文献报道的方法试验却发现检测不到代谢产物，底物量也不见减少。请同道中人指教，不胜感激！
为了鉴定乌头碱的体外代谢产物，0.5ml反应体系含150mM Tris-HCl 缓冲液（pH=7.4），5mM MgCl2， 1mg/ml 微粒体蛋白和40uM乌头碱，反应体系在37度预孵育3分钟后，向体系中加入50uL NADPH（20mM/L）启动反应，震荡水浴上孵育60分钟，而后向体系中加入4mL冰冷的二氯甲烷终止反应，涡旋震荡后4500g离心10分钟，取有机相3.5mL氮气吹干，而后用250uL流动相溶解进样。
按此法操作后，并未像文献中报道的那样发生代谢，而后改进缓冲液，即向缓冲液中加入甘油/EDTA/DTT，仍未见代谢发生，又有人说向体系中饱和氧气会好些，依法做后仍未见代谢，遂求高人指教！
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风一样的u然自得
1楼 2010-01-08 13:02:19
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zhongjie

木虫 (正式写手)
★ ★
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karl2100(金币+1):谢谢回复！ 2010-05-12 22:04:59
如果你所加试剂都是正常的话，应该有反应的。
NADPH是否按照要求保存？
代谢物检测方法是否灵敏？
设一个阳性对照，如果正常，那么你的体系就没问题。
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8楼2010-05-11 21:10:00
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hnw721

铁杆木虫 (著名写手)
★ ★
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ynmyx(金币+1,VIP+0):谢谢您的热心解惑！！ 1-8 15:48
http://jpck.zju.edu.cn/ywfxjpkc/kcjj/lunw/17.pdf
你看一下这篇文章哈，因为我没做过这方面的，具体也不是很清楚了！
赞一下(12人) 回复此楼
3楼2010-01-08 14:35:29
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guona0329

木虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
楼主问题解决了吗？确定是在预孵育的时候就加肝微粒体吗？我怎么看别的论坛中有人说不能先加呢？我也是刚刚接触这方面的东西，但是只是在准备过程中，没真正开始呢，希望多多交流经验！
赞一下(1人) 回复此楼
幸福就在你身边~~~
4楼2010-03-12 22:41:29
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程程9122

铁虫 (小有名气)
★ ★
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472514568(金币+1):谢谢回帖！ 2010-03-21 00:23
我看过一些文章，有的就像你这样，有的不光要加辅酶2，而且还要有一系列的再生系统，以持续提供NADPH，不知道是不是这个原因
赞一下(2人) 回复此楼
5楼2010-03-20 22:58:04
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