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1121prettycat

木虫 (正式写手)

[交流] 【求助/交流】关于MTT法吸光度值偏小 已有4人参与

目前正在用MTT法测定细胞存活率,步骤是将培养液吸出后,加入200微升MTT,37°孵育3到4个小时,然后加入150微升DMSO,想问一下大家用的检测波长和参考波长都是多少,我目前用的是490nm的检测波长和650nm的测定波长,现在用490nm得到的吸光度值包括对照都不到0.2,大约在0.17左右,650nm检测得到的数据大约都在0.05或者0.06,不知道吸光度值偏小是因为孵育时间不够还是与细胞有关,因为使用别的细胞的时候吸光度值都没有这么小,想问一下吸光度这么小数据能否使用?
还有数据处理的时候是不是应该用各孔在490nm检测时得到的数值-650nm检测时得到的数值?
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kellysun

金虫 (小有名气)

引用回帖:
Originally posted by gaozx123 at 2010-01-22 09:12:26:


加完DMSO后,盖上盖子后,室温下轻微震荡摇晃10分钟就OK了。
吸光值的话,大家都用490nm

呵呵,谢谢啦
13楼2010-01-26 08:32:28
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nicknelson

至尊木虫 (职业作家)

★ ★ ★ ★
1121prettycat(金币+1):谢谢参与
1121prettycat(金币+1,VIP+0): 1-8 14:09
1949stone(金币+2,VIP+0): 1-8 18:04
用的细胞数量太少,或者你的细胞特殊,不适合MTT染色。
2楼2010-01-08 11:28:32
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gaozx123

金虫 (小有名气)

★ ★ ★ ★
1121prettycat(金币+1):谢谢参与
amisking(金币+3,VIP+0): 1-8 17:28
请问你用的MTT是多大浓度的?怎么加200ul啊。
我用的MTT是2mg/ml的,每孔加50ul,(有的用5mg/ml,每孔加20ul),孵育3h后,加150ulDMSO溶解,用490nm和630nm测吸光值,也就是你说的检测波长与参照波长。
吸光值最好在0.2-0.8范围内,因为这个是最准确的。你测得值小,可能与接种的细胞量有关,还有就是MTT的用量。
数据处理时是需要相减的,即A490-A630。
3楼2010-01-08 11:30:43
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1121prettycat

木虫 (正式写手)

加的5mg/L的MTT,每孔200微升,用的是原代培养的大鼠小脑颗粒神经元,接种密度7.5万,在培养1d后加药,加药1d和7d后测定
4楼2010-01-08 14:19:05
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