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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】taq-Pfu
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【有奖交流】积极回复本帖子，参与交流，就有机会分得作者 xiangao 的 4 个金币

xiangao

金虫 (正式写手)

[交流] 【求助/交流】taq-Pfu

用taq 酶在一温度下p一段基因，没有问题而且特异性很好。
但是改成用Pfu酶p这段基因，延伸时间加倍，就是p不出来，而且上下也摸索了几个温度也没p出来，好奇怪啊！！！！Pfu酶本身应该没问题
请帮忙分析原因  ！！！！！！！！！！！！！！
纠结中！！！！！！！！！！
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1楼 2010-01-03 17:30:55
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米菲的旋律

木虫 (著名写手)

Always Keep The Faith！
★ ★ ★
xiangao(金币+2,VIP+0):谢谢应助 1-3 18:28
1949stone(金币+1,VIP+0):再奖一次 1-3 19:52
pfu活性较低，延伸速度慢，对溶液要求高。
我曾用过fermentas的pfu，牌子应该是不错了，也没p出来。原因就是模板是手提的，残留不少有害物质。我的解决办法是镁离子浓度。

你可以尝试提高镁离子浓度，（但是注意，镁离子浓度过高，影响pfu特异性）。
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物必先腐而后虫生
2楼2010-01-03 18:21:13
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xiangao

金虫 (正式写手)
这样的问题好像不多见 ，，大家遇到过没？
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3楼2010-01-03 18:30:13
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
★ ★
amisking(金币+1,VIP+0): 1-3 19:04
xiangao(金币+1,VIP+0): 1-4 14:13
pfu和pfx的扩增能力就是差点的啦，所以我现在习惯用具有一定保证性的Taq或者Taq与Pfu混合酶
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4楼2010-01-03 19:01:00
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695

木虫 (职业作家)
★
xiangao(金币+1,VIP+0): 1-4 14:13
没碰到过，当时第一次做的时候简直太顺手了
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5楼2010-01-03 20:47:52
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gdongli8325

铁杆木虫 (正式写手)
★
xiangao(金币+1,VIP+0): 1-4 14:13
是不是用配套的PFU的buffer? 如果不是配套的，有可能扩不出来，因为离子浓度不一样，pfu的浓度高，需要的变性温度也高。我之前用TAq但是用pfu的buffer，怎么也扩不出来，但是用相应的酶就扩出来了。
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6楼2010-01-04 01:34:50
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fungixx

至尊木虫 (文坛精英)

优秀版主优秀版主优秀版主
★
xiangao(金币+1,VIP+0): 1-4 14:12
很正常，特异性高了扩增效率肯定会低的。你可以用一下taq plus，保真性也不错，扩增效率跟taq差不多
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几年前踏上火车那一刻都还没有意识到,从此故乡只有冬夏,再无春秋
7楼2010-01-04 08:54:45
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lansha8331

无虫 (小有名气)
很正常，pfu酶保真性好，但代价就是需要的条件苛刻，扩增效率不高，但只要扩出来的，出错率极低。如果用Taq酶就能扩出来，干吗还用pfu啊，除非是为了测序
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8楼2010-03-18 11:33:05
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lansha8331

无虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by lansha8331 at 2010-03-18 11:33:05:
很正常，pfu酶保真性好，但代价就是需要的条件苛刻，扩增效率不高，但只要扩出来的，出错率极低。如果用Taq酶就能扩出来，干吗还用pfu啊，除非是为了测序

另外推荐威格拉斯公司的Taq和pfu酶
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9楼2010-03-18 11:33:43
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huangdi07

铁杆木虫 (小有名气)
我感觉有可能是手提模板含有杂质太多赵城的 可以试试用基因组试剂盒提一下看看 pfu酶的扩增效率比较低 另外可以适当的降低一下退火温度 用touchdown pcr试试
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10楼2010-03-18 14:28:48
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