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xiangao

金虫 (正式写手)

[交流] 【求助/交流】taq-Pfu

用taq 酶在一温度下p一段基因,没有问题而且特异性很好。
但是改成用Pfu酶p这段基因,延伸时间加倍,就是p不出来,而且上下也摸索了几个温度也没p出来,好奇怪啊!!!!Pfu酶本身应该没问题
请帮忙分析原因  !!!!!!!!!!!!!!
纠结中!!!!!!!!!!
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米菲的旋律

木虫 (著名写手)

Always Keep The Faith!

★ ★ ★
xiangao(金币+2,VIP+0):谢谢应助 1-3 18:28
1949stone(金币+1,VIP+0):再奖一次 1-3 19:52
pfu活性较低,延伸速度慢,对溶液要求高。
我曾用过fermentas的pfu,牌子应该是不错了,也没p出来。原因就是模板是手提的,残留不少有害物质。我的解决办法是镁离子浓度。

你可以尝试提高镁离子浓度,(但是注意,镁离子浓度过高,影响pfu特异性)。
物必先腐而后虫生
2楼2010-01-03 18:21:13
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xiangao

金虫 (正式写手)

这样的问题好像不多见 ,,大家遇到过没?
3楼2010-01-03 18:30:13
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)

★ ★
amisking(金币+1,VIP+0): 1-3 19:04
xiangao(金币+1,VIP+0): 1-4 14:13
pfu和pfx的扩增能力就是差点的啦,所以我现在习惯用具有一定保证性的Taq或者Taq与Pfu混合酶
4楼2010-01-03 19:01:00
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695

木虫 (职业作家)

★
xiangao(金币+1,VIP+0): 1-4 14:13
没碰到过,当时第一次做的时候简直太顺手了
5楼2010-01-03 20:47:52
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gdongli8325

铁杆木虫 (正式写手)

★
xiangao(金币+1,VIP+0): 1-4 14:13
是不是用配套的PFU的buffer? 如果不是配套的,有可能扩不出来,因为离子浓度不一样,pfu的浓度高,需要的变性温度也高。我之前用TAq但是用pfu的buffer,怎么也扩不出来,但是用相应的酶就扩出来了。
6楼2010-01-04 01:34:50
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fungixx

至尊木虫 (文坛精英)

优秀版主优秀版主优秀版主

★
xiangao(金币+1,VIP+0): 1-4 14:12
很正常,特异性高了扩增效率肯定会低的。你可以用一下taq plus,保真性也不错,扩增效率跟taq差不多
几年前踏上火车那一刻都还没有意识到,从此故乡只有冬夏,再无春秋
7楼2010-01-04 08:54:45
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lansha8331

无虫 (小有名气)

很正常,pfu酶保真性好,但代价就是需要的条件苛刻,扩增效率不高,但只要扩出来的,出错率极低。如果用Taq酶就能扩出来,干吗还用pfu啊,除非是为了测序
8楼2010-03-18 11:33:05
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lansha8331

无虫 (小有名气)

引用回帖:
Originally posted by lansha8331 at 2010-03-18 11:33:05:
很正常,pfu酶保真性好,但代价就是需要的条件苛刻,扩增效率不高,但只要扩出来的,出错率极低。如果用Taq酶就能扩出来,干吗还用pfu啊,除非是为了测序

另外推荐威格拉斯公司的Taq和pfu酶
9楼2010-03-18 11:33:43
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huangdi07

铁杆木虫 (小有名气)

我感觉有可能是手提模板含有杂质太多赵城的 可以试试用基因组试剂盒提一下看看 pfu酶的扩增效率比较低 另外可以适当的降低一下退火温度 用touchdown pcr试试
10楼2010-03-18 14:28:48
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