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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】质粒pcr假阳性问题
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wordsworth3180

木虫 (正式写手)

[交流] 【求助/交流】质粒pcr假阳性问题

请问大家，筛选重组克隆时，用碱裂解法提取转化子的质粒，然后用提取的质粒做模板进行pcr验证。虽然提取的质粒有时弥散，但pcr为阳性，这种情况下，请问虫虫们，假阳性的概率多大？
因为测序需要自己设计引物，所以想有把握了再测序，希望大家给分析一下！
多谢了！
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1楼 2009-12-30 20:03:10
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匿名

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2楼2009-12-31 07:21:05
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匿名

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3楼2009-12-31 07:25:21
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yangym1123

木虫 (小有名气)
★
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一般我们都是用菌液PCR用自己的特异引物来验证的，有一定的假阳性率，我做了三年也就出来一两个假阳性吧，整理提取后酶切验证时最好的办法，如果切下来你的目的条带，说明载体上肯定有你的插入片段啊，另外提取的质粒弥散可能是因为有蛋白（DNA酶的污染），再重提就是啦！
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4楼2009-12-31 08:49:36
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wordsworth3180

木虫 (正式写手)
插入片段只有100bp， 酶切也不一定看的出来啊 ~
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5楼2009-12-31 11:58:40
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tianpingpe

新虫 (小有名气)
★
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100bp电泳还是看的出来的，只有没有跑出胶
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6楼2009-12-31 13:54:00
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lixg

铁杆木虫 (正式写手)
★
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先做菌落PCR,然后将阳性克隆摇菌提质粒做酶切鉴定。
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7楼2009-12-31 15:05:56
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leunglm

银虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by 彬心玉壶 at 2009-12-31 07:25:
克隆后筛选的时候第一轮先不用提质粒吧，最好用载体引物可以做个菌落PCR先验证一下，这样验证会好很多。

再就是测序貌似可以直接送纯菌落吧，如果你的载体是常用的载体，那些引物测序公司都有，让他们用载体引 ...

同意！！
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8楼2009-12-31 15:30:48
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linxi8579

铜虫 (正式写手)
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引用回帖:
Originally posted by yangym1123 at 2009-12-31 08:49:
一般我们都是用菌液PCR用自己的特异引物来验证的，有一定的假阳性率，我做了三年也就出来一两个假阳性吧，整理提取后酶切验证时最好的办法，如果切下来你的目的条带，说明载体上肯定有你的插入片段啊，另外提取的 ...

曾经见过菌液PCR好处的相关描述，可是给实验室的同志建议以后仍然用菌落PCR。请问您能否把菌液PCR的好处和操作方法指点一下，不胜感激。
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9楼2009-12-31 16:59:55
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匿名

用户注销 (著名写手)
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10楼2009-12-31 17:47:26
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