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wordsworth3180

木虫 (正式写手)

[交流] 【求助/交流】质粒pcr假阳性问题

请问大家,筛选重组克隆时,用碱裂解法提取转化子的质粒,然后用提取的质粒做模板进行pcr验证。虽然提取的质粒有时弥散,但pcr为阳性,这种情况下,请问虫虫们,假阳性的概率多大?
因为测序需要自己设计引物,所以想有把握了再测序,希望大家给分析一下!
多谢了!
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匿名

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2楼2009-12-31 07:21:05
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匿名

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3楼2009-12-31 07:25:21
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yangym1123

木虫 (小有名气)


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一般我们都是用菌液PCR用自己的特异引物来验证的,有一定的假阳性率,我做了三年也就出来一两个假阳性吧,整理提取后酶切验证时最好的办法,如果切下来你的目的条带,说明载体上肯定有你的插入片段啊,另外提取的质粒弥散可能是因为有蛋白(DNA酶的污染),再重提就是啦!
4楼2009-12-31 08:49:36
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wordsworth3180

木虫 (正式写手)

插入片段只有100bp, 酶切也不一定看的出来啊 ~
5楼2009-12-31 11:58:40
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tianpingpe

新虫 (小有名气)


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100bp电泳还是看的出来的,只有没有跑出胶
6楼2009-12-31 13:54:00
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lixg

铁杆木虫 (正式写手)


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先做菌落PCR,然后将阳性克隆摇菌提质粒做酶切鉴定。
7楼2009-12-31 15:05:56
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leunglm

银虫 (小有名气)

引用回帖:
Originally posted by 彬心玉壶 at 2009-12-31 07:25:
克隆后筛选的时候第一轮先不用提质粒吧,最好用载体引物可以做个菌落PCR先验证一下,这样验证会好很多。

再就是测序貌似可以直接送纯菌落吧,如果你的载体是常用的载体,那些引物测序公司都有,让他们用载体引 ...

同意!!
8楼2009-12-31 15:30:48
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linxi8579

铜虫 (正式写手)


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引用回帖:
Originally posted by yangym1123 at 2009-12-31 08:49:
一般我们都是用菌液PCR用自己的特异引物来验证的,有一定的假阳性率,我做了三年也就出来一两个假阳性吧,整理提取后酶切验证时最好的办法,如果切下来你的目的条带,说明载体上肯定有你的插入片段啊,另外提取的 ...

曾经见过菌液PCR好处的相关描述,可是给实验室的同志建议以后仍然用菌落PCR。请问您能否把菌液PCR的好处和操作方法指点一下,不胜感激。
9楼2009-12-31 16:59:55
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匿名

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10楼2009-12-31 17:47:26
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