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358219418金虫 (正式写手)
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[交流]
【求助/交流】请教高手，谢谢
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我做的基因编码的氨基酸N端有信号肽，预测蛋白分子量68kD。构建的重组质粒为peT-32-a重组质粒，转入BL21后提质粒，PCR和双酶切鉴定都没问题。 将重组菌37度摇床培养，5小时后加IPTG终浓度0.1mM，诱导5小时后取1mL离心，弃上清，加PBS，加上样buffer,100度，3分钟，离心后加样跑SDS-PAGE。染色脱色后没有目的蛋白，什么原因。 麻烦高手指点，十分感谢哈！ |
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amisking(金币+5,VIP+0): 12-29 19:29
358219418(金币+2,VIP+0):谢谢你的意见！考虑的很全面，只是前三个都排除了，第四个原因：我用的是我们实验室常用的浓度，也许要改变一下吧 12-30 10:24
amisking(金币+5,VIP+0): 12-29 19:29
358219418(金币+2,VIP+0):谢谢你的意见！考虑的很全面，只是前三个都排除了，第四个原因：我用的是我们实验室常用的浓度，也许要改变一下吧 12-30 10:24
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有几个问题： 1.pet32a有trx基因，你是不是做的融合表达，确定目的蛋白大小 2.信号肽没有作用且会影响原核表达，应该去掉 3.稀有碱基含量多不多，可以换用能表达稀有碱基的菌株 4.诱导条件需要摸索，比如起始诱导时od600最好在0.5-0.8之间，你实验中“重组菌37度摇床培养，5小时后加IPTG”可能不合适，还有诱导表达最好从IPTG终浓度1mM开始，不建议从0.1mM开始试验 |
3楼2009-12-29 17:00:32
忘记将来
木虫 (正式写手)
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2楼2009-12-29 16:08:10
thinka
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5楼2009-12-30 00:22:45
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