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358219418

金虫 (正式写手)

[交流] 【求助/交流】请教高手，谢谢

我做的基因编码的氨基酸N端有信号肽，预测蛋白分子量68kD。构建的重组质粒为peT-32-a重组质粒，转入BL21后提质粒，PCR和双酶切鉴定都没问题。
    将重组菌37度摇床培养，5小时后加IPTG终浓度0.1mM，诱导5小时后取1mL离心，弃上清，加PBS，加上样buffer,100度，3分钟，离心后加样跑SDS-PAGE。染色脱色后没有目的蛋白，什么原因。

麻烦高手指点，十分感谢哈！
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木虫，快乐并坚强着
1楼 2009-12-29 14:53:47
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忘记将来

木虫 (正式写手)
貌似根本就没有表达，做一个高IPTG高温和低IPTG低温的实验，基本上就可以判断他有没有表达了。
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2楼2009-12-29 16:08:10
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jasco

木虫 (正式写手)
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
amisking(金币+5,VIP+0): 12-29 19:29
358219418(金币+2,VIP+0):谢谢你的意见！考虑的很全面，只是前三个都排除了，第四个原因：我用的是我们实验室常用的浓度，也许要改变一下吧 12-30 10:24
有几个问题：
1.pet32a有trx基因，你是不是做的融合表达，确定目的蛋白大小
2.信号肽没有作用且会影响原核表达，应该去掉
3.稀有碱基含量多不多，可以换用能表达稀有碱基的菌株
4.诱导条件需要摸索，比如起始诱导时od600最好在0.5-0.8之间，你实验中“重组菌37度摇床培养，5小时后加IPTG”可能不合适，还有诱导表达最好从IPTG终浓度1mM开始，不建议从0.1mM开始试验
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3楼2009-12-29 17:00:32
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thinka

铜虫 (著名写手)
★ ★
amisking(金币+2,VIP+0): 12-29 19:29
原核表达这东西就这样,有时候得长期抗战,死而后已.看你的描述好像你没测序,先保证你的序列正确吧,尤其是确定你的读码框没有问题,再次看看你的密码子是不是太多稀有密码子了.推荐蛋白分析软件seqtools
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4楼2009-12-29 17:11:08
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冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)

生物大分子降解酶
不好意思，我弱弱的问一下，蛋白质变性之后在你的离心条件下是上清还是沉淀？
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流星来时我许了个愿，愿我有吃有喝还有舒服的猪圈。讨厌发帖前不搜索论坛重复发帖和仅把论坛当解决问题工具，久不看论坛一来就提问者，宁弃EPI和VIP也不回帖。
5楼2009-12-30 00:22:45
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358219418

金虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by thinka at 2009-12-29 17:11:
原核表达这东西就这样,有时候得长期抗战,死而后已.看你的描述好像你没测序,先保证你的序列正确吧,尤其是确定你的读码框没有问题,再次看看你的密码子是不是太多稀有密码子了.推荐蛋白分析软件seqtools

测序了，没有问题的，序列分析也做了，也没得问题。还是谢谢你哈！
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木虫，快乐并坚强着
6楼2009-12-30 10:20:39
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358219418

金虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by 忘记将来 at 2009-12-29 16:08:
貌似根本就没有表达，做一个高IPTG高温和低IPTG低温的实验，基本上就可以判断他有没有表达了。

谢谢哈！
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木虫，快乐并坚强着
7楼2009-12-30 10:21:06
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358219418

金虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by 冼亮淀粉酶 at 2009-12-30 00:22:
不好意思，我弱弱的问一下，蛋白质变性之后在你的离心条件下是上清还是沉淀？

上清哦，谢谢！
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木虫，快乐并坚强着
8楼2009-12-30 10:21:41
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