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358219418

金虫 (正式写手)

[交流] 【求助/交流】请教高手,谢谢

我做的基因编码的氨基酸N端有信号肽,预测蛋白分子量68kD。构建的重组质粒为peT-32-a重组质粒,转入BL21后提质粒,PCR和双酶切鉴定都没问题。
    将重组菌37度摇床培养,5小时后加IPTG终浓度0.1mM,诱导5小时后取1mL离心,弃上清,加PBS,加上样buffer,100度,3分钟,离心后加样跑SDS-PAGE。染色脱色后没有目的蛋白,什么原因。

麻烦高手指点,十分感谢哈!
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木虫,快乐并坚强着
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358219418

金虫 (正式写手)

引用回帖:
Originally posted by thinka at 2009-12-29 17:11:
原核表达这东西就这样,有时候得长期抗战,死而后已.看你的描述好像你没测序,先保证你的序列正确吧,尤其是确定你的读码框没有问题,再次看看你的密码子是不是太多稀有密码子了.推荐蛋白分析软件seqtools

测序了,没有问题的,序列分析也做了,也没得问题。还是谢谢你哈!
木虫,快乐并坚强着
6楼2009-12-30 10:20:39
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358219418

金虫 (正式写手)

引用回帖:
Originally posted by 忘记将来 at 2009-12-29 16:08:
貌似根本就没有表达,做一个高IPTG高温和低IPTG低温的实验,基本上就可以判断他有没有表达了。

谢谢哈!
木虫,快乐并坚强着
7楼2009-12-30 10:21:06
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358219418

金虫 (正式写手)

引用回帖:
Originally posted by 冼亮淀粉酶 at 2009-12-30 00:22:
不好意思,我弱弱的问一下,蛋白质变性之后在你的离心条件下是上清还是沉淀?

上清哦,谢谢!
木虫,快乐并坚强着
8楼2009-12-30 10:21:41
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