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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】8kb的片段连接之后却变成了6kb左右！
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xiangyuan7816

[交流] 【求助/交流】8kb的片段连接之后却变成了6kb左右！

片段太大，几次都没连上载体，最后用一种无奈的方法，将片段连到pmd18-t上，这个载体大小为2692kb，一般连5kb之下的片段比较容易成功，这次连接之后，竟然长出了一个菌斑，挑取之后用这个基因的两端酶切之后应该是8.3kb的片段，但跑胶之后发现片段却是6kb左右，本来有图片，但不知道怎么上传，请高手指教！
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1楼 2009-12-16 12:31:35
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xiangyuan7816

★ ★
amisking(金币+2,VIP+0):欢迎上图！ 12-17 08:37
用的Marker的带依次为：23130bp、9416bp、6557bp、4361bp、2322bp、2027bp、564bp
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2楼2009-12-16 12:36:24
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冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)

生物大分子降解酶
★ ★ ★
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amisking(金币+2,VIP+0): 12-17 08:37
曾经我连接一段2KB的DNA转化大肠杆菌，结果出来好几种连接情况的，比正确片段大的小的都有。如果连接的是完整的一个酶基因就可以用活性筛选出来，但我连接的是基因的片段，最后只能挑选了一种连接正确的去测序，序列比对结果跟预想中一致。至于为什么，我也不知道。
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流星来时我许了个愿，愿我有吃有喝还有舒服的猪圈。讨厌发帖前不搜索论坛重复发帖和仅把论坛当解决问题工具，久不看论坛一来就提问者，宁弃EPI和VIP也不回帖。
3楼2009-12-16 13:04:47
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冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)

生物大分子降解酶
曾经试过连接基因的，单酶切口，结果有的载体连接上两个拷贝基因，就比原来预想中的大了两倍，估计也是连接得很乱的，但是有活性就好筛选了。
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流星来时我许了个愿，愿我有吃有喝还有舒服的猪圈。讨厌发帖前不搜索论坛重复发帖和仅把论坛当解决问题工具，久不看论坛一来就提问者，宁弃EPI和VIP也不回帖。
4楼2009-12-16 13:07:49
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xiangyuan7816

引用回帖:
Originally posted by 冼亮淀粉酶 at 2009-12-16 13:07:
曾经试过连接基因的，单酶切口，结果有的载体连接上两个拷贝基因，就比原来预想中的大了两倍，估计也是连接得很乱的，但是有活性就好筛选了。

我连接的是酶，请问用活性怎么筛选啊？

[ Last edited by xiangyuan7816 on 2009-12-16 at 13:27 ]
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5楼2009-12-16 13:25:11
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忘记将来

木虫 (正式写手)
★
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看看选的酶是不是有问题，目的片段上有没有该酶切位点呢。
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6楼2009-12-16 13:51:25
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xiangyuan7816

引用回帖:
Originally posted by 忘记将来 at 2009-12-16 13:51:
看看选的酶是不是有问题，目的片段上有没有该酶切位点呢。

应该不是吧，我反复验证过的，我用的酶在我的那个片段里是没有的。还有什么可能使那个片段变小呢？
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7楼2009-12-16 14:34:01
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apple-z

银虫 (小有名气)
★ ★ ★
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amisking(金币+2,VIP+0): 12-17 08:37
不知道你连接的片段是酶切的产物还是PCR的产物，如果是PCR产物有没有PCR后跑胶鉴定，如果没有的话，就有可能是PCR除了问题。比如由于你片段自身的原因，很容易与引物发生非特异性结合，造成部分碱基的丢失。
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8楼2009-12-16 22:54:51
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liyong1981

金虫 (正式写手)
★
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很怀疑你扩的片度的真实度，呵呵，
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9楼2009-12-17 08:27:43
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xiangyuan7816

引用回帖:
Originally posted by apple-z at 2009-12-16 22:54:
不知道你连接的片段是酶切的产物还是PCR的产物，如果是PCR产物有没有PCR后跑胶鉴定，如果没有的话，就有可能是PCR除了问题。比如由于你片段自身的原因，很容易与引物发生非特异性结合，造成部分碱基的丢失。

我连接的片段是PCR产物，因为是连接到T载体上，所以可以直接连。本来之前的打算是片段太大，直接连到表达载体上，但没有成功，所以又回过头来按照一般的构建方法，先连T载体，再连表达载体。我PCR产物跑胶确定是8Kb左右，这个酶切之后却变成了6kb左右，确实想不明白是怎么回事，今天我用质粒进行了PCR扩那个8Kb的片段。
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10楼2009-12-17 14:01:08
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