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xiangyuan7816

[交流] 【求助/交流】8kb的片段连接之后却变成了6kb左右!

片段太大,几次都没连上载体,最后用一种无奈的方法,将片段连到pmd18-t上,这个载体大小为2692kb,一般连5kb之下的片段比较容易成功,这次连接之后,竟然长出了一个菌斑,挑取之后用这个基因的两端酶切之后应该是8.3kb的片段,但跑胶之后发现片段却是6kb左右,本来有图片,但不知道怎么上传,请高手指教!
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apple-z

银虫 (小有名气)

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amisking(金币+2,VIP+0): 12-17 08:37
不知道你连接的片段是酶切的产物还是PCR的产物,如果是PCR产物有没有PCR后跑胶鉴定,如果没有的话,就有可能是PCR除了问题。比如由于你片段自身的原因,很容易与引物发生非特异性结合,造成部分碱基的丢失。
8楼2009-12-16 22:54:51
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xiangyuan7816

★ ★
amisking(金币+2,VIP+0):欢迎上图! 12-17 08:37
用的Marker的带依次为:23130bp、9416bp、6557bp、4361bp、2322bp、2027bp、564bp
2楼2009-12-16 12:36:24
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冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)

生物大分子降解酶

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amisking(金币+2,VIP+0): 12-17 08:37
曾经我连接一段2KB的DNA转化大肠杆菌,结果出来好几种连接情况的,比正确片段大的小的都有。如果连接的是完整的一个酶基因就可以用活性筛选出来,但我连接的是基因的片段,最后只能挑选了一种连接正确的去测序,序列比对结果跟预想中一致。至于为什么,我也不知道。
流星来时我许了个愿,愿我有吃有喝还有舒服的猪圈。讨厌发帖前不搜索论坛重复发帖和仅把论坛当解决问题工具,久不看论坛一来就提问者,宁弃EPI和VIP也不回帖。
3楼2009-12-16 13:04:47
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冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)

生物大分子降解酶

曾经试过连接基因的,单酶切口,结果有的载体连接上两个拷贝基因,就比原来预想中的大了两倍,估计也是连接得很乱的,但是有活性就好筛选了。
流星来时我许了个愿,愿我有吃有喝还有舒服的猪圈。讨厌发帖前不搜索论坛重复发帖和仅把论坛当解决问题工具,久不看论坛一来就提问者,宁弃EPI和VIP也不回帖。
4楼2009-12-16 13:07:49
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