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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】有关western blotting的求救
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liwen410

新虫 (初入文坛)

[交流] 【求助/交流】有关western blotting的求救 已有7人参与

本人是一个新手，最近两个月都在做western blotting检测目的蛋白的表达。但是结果不理想。因为目的蛋白表达得很少，显影显不出来，显色更显不出来。有一次显出来，但接着又重复不出来。即便显出来，那个条带也是隐隐约约的，因为背景太强了。找了很多原因，包括：增加蛋白上样量，膜多洗几次，等等。效果都不理想。实在不知道问题出在哪里。有时觉得是不是自己真的不适合做科研呢？
在下虚心向各位高手请教，万分感谢。
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1楼 2009-12-15 20:41:44
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
有时候是你的蛋白特别难做而已……或者抗体不大好
在做什么蛋白呢？用的哪个公司的抗体。说不定论坛里有人做过可以给你建议
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2楼2009-12-15 20:57:54
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liwen410

新虫 (初入文坛)
先谢谢三磷酸腺苷了，我也不知道是我的蛋白难做，还是技术不到家。
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3楼2009-12-15 21:15:19
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程涛

至尊木虫 (著名写手)
多做几次就行了
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4楼2010-04-10 19:20:59
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liyingye001

新虫 (初入文坛)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
我也出现同样的问题，求高手指教
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5楼2011-03-20 17:54:12
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lavender169

木虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
首先  抗体很重要  你要做的目标蛋白和抗体的来源一定不能是同一种 否则就会出现你说的这种  隐约能看到目标蛋白  但是背景估计比你的目标蛋白还清晰 而且相当的杂乱
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::::::::::::::::jusmine:::::::::::::::
6楼2011-03-29 14:01:08
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terry130

木虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
除了抗体的问题外，有些丰度很低的蛋白就是这个样子的，很难做。一抗浓一些，1:100-1:500. 4度ON，二抗无所谓。洗膜时间长一些，可以十分钟一次，洗六次。这样最大限度降低背景。之后曝光两个小时。这样还没有带的话就考虑换抗体吧~~~~

另外，如果你的lysate是全细胞的话，上样量尽可能大一些，30ug总蛋白/lane 试试。
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摒气动方息，宁神心自明。
7楼2011-03-29 14:53:18
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lixinna2009

新虫 (初入文坛)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
如果是弱的带可以增加蛋白上样量，在没有就应该是你抗体的原因，而且一般背景都不会太深，要是太深说明抗体质量不好
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8楼2011-03-30 10:51:43
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luohuacheng

新虫 (小有名气)
有些东西需要摸索，不同的实验室，同样的protocol，做的过程是需要稍加改变的。再摸索一下吧
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9楼2011-04-27 22:34:34
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dancy19

铜虫 (初入文坛)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
背景太暗的话可以将BLOCKING的时间延长些，我们一般都block过夜
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10楼2011-04-29 14:45:28
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