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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】10Kb长片段连接求助 急！！！
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tuodecai

铁杆木虫 (著名写手)

[交流] 【求助/交流】10Kb长片段连接求助 急！！！

向各位仁者求助，谁有连过大片段的经验？或有用过invitrogen TOPO XL PCR Cloning Kit 的吗？该盒子的载体是说可以连3—10kb的片段，我的片段就有10kb，可我连了两次了都没连上的。转化效率特高，每个板上长了几百个，可鉴定插入的都是些才1kb的小片段。希望师兄师姐们给点儿建议，或有更好的载体推荐一下。先谢谢了！
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1楼 2009-12-08 11:34:46
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susizheng

木虫 (著名写手)

我們是糖 甜到憂傷
★
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请问下为什么插入了1kb的片段呢？目的片段没有做回收？
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Thank-you，so-blue.
2楼2009-12-08 18:17:32
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won7

金虫 (小有名气)
★ ★ ★
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amisking(金币+2,VIP+0): 12-8 20:23
我用过invitrogen TOPO XL PCR Cloning Kit 连接3kb的产物，效率很高。估计是你产物没有回收好，回收时不要用EB电泳，否则在紫外线下DNA受到损伤，对连接很有影响。建议用试剂盒附带的燃料和回收试剂回收。
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3楼2009-12-08 20:12:49
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zhuifeng7000

至尊木虫 (著名写手)
★
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引用回帖:
Originally posted by tuodecai at 2009-12-8 11:34:
向各位仁者求助，谁有连过大片段的经验？或有用过invitrogen TOPO XL PCR Cloning Kit 的吗？该盒子的载体是说可以连3—10kb的片段，我的片段就有10kb，可我连了两次了都没连上的。转化效率特高，每个板上长了几百 ...

重新将你的大片段回收下，可能回收的不干净，跑胶的时候把电压放的慢一些，使大片段与小片段彻底分开。还有就是你连的时候是平端连还是用酶切位点呢？
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4楼2009-12-08 22:24:24
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
★ ★ ★
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amisking(金币+2,VIP+0): 12-10 11:33
利用TOPO的方法，我倒没试过
你可以查查这个酶在低温有没有活性，然后试试低温过夜连
因为T4连大片段或者超小片段都是4度过夜连的
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5楼2009-12-08 22:49:57
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tuodecai

铁杆木虫 (著名写手)

10Kb长片段连接求助 急！！！

引用回帖:
Originally posted by won7 at 2009-12-8 20:12:
我用过invitrogen TOPO XL PCR Cloning Kit 连接3kb的产物，效率很高。估计是你产物没有回收好，回收时不要用EB电泳，否则在紫外线下DNA受到损伤，对连接很有影响。建议用试剂盒附带的燃料和回收试剂回收。

谢谢！我是按试剂盒的要求做胶回收的，也没在紫外下照，而且回收后跑胶感觉效果也挺好的，比较纯，也没见小片段等杂带，但浓度不高。所以我应该不能将回收产物再做一次胶回收了，因为浓度低了跑胶是看不见的，没办法切胶回收，我第一次做胶回收的时候就没做成。在这儿我想详细咨询你以下问题：
1、你连3kb的一次就成功了吗？你做的时候一个板涂了多少µl ，长了大概多少个，你挑10个的话有几个是的？我涂了150µl ，第一次转的长了两百个，第二次转化的长得更多，会有七八百个，几乎是一片都快没办法挑菌了。我挑了两三次做菌液PCR鉴定，每次也挑了20-30个菌可都是没有连上的。
2、请问你也是用菌液PCR鉴定的吗？用的是试剂盒里的载体引物还是特异引物？酶用一般的聚合酶就可以的吧？没必要用主要试剂盒上推荐的吧，还有做菌液PCR时预变性时间你用多久，我用10min会不太长。
3、你做连接时是通过测OD后计算浓度后来确定连接体系里载体和模板的量吗？我担心咱们实验室测OD的机器不准了，就没有测过，直接按说明书上加的。昨天我测了下，大概90ng/µl ，不过应该不准。
  你觉得我哪里会有问题的地方，望你多多指教。这个实验我都搞了半年了，老板急了，催得紧，做不出来天天挨骂。真诚向你请教了！再次感谢各位。
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6楼2009-12-09 14:22:28
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won7

金虫 (小有名气)
★
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Originally posted by tuodecai at 2009-12-9 14:22:


   谢谢！我是按试剂盒的要求做胶回收的，也没在紫外下照，而且回收后跑胶感觉效果也挺好的，比较纯，也没见小片段等杂带，但浓度不高。所以我应该不能将回收产物再做一次胶回收了，因为浓度低了跑胶是看不见 ...

这个试剂盒我连过3次，均是一次成功，所以感觉这个试剂盒还不错。我也是使用150ul涂板，长得也不少，没有具体估算，但应该在500个以上。我挑12个克隆，有8－10个是与目的片段相等的，测其中2个均为目的片段。只有一次检测中出现1个空载，其余均有插入。

     阳性鉴定也是用菌液PCR方法，10ul体积中加1ul菌液。引物用试剂带的通用引物即M13，但酶使用的是TAKARA的LA Taq。我用一般的Taq酶试过，但也没有产物，估计是片段太长，一般的酶难以扩增这么长的。预变性我都是用3min，太长的预变性时间是否有影响很难说，但其实没有必要用10min。

      连接模板的浓度我没有测，都是估计的。我想这不是主要问题吧。

     建议你采用扩增能够长片段的Taq重新检测一下，你认为没有连上的克隆，这可能是关键，因为我看试剂盒的连接原理，应该不会出现这么高的空载，除非你在电转时没有仔细而造成污染。

  最后祝你实验顺利，少挨批评！呵呵
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7楼2009-12-09 17:02:45
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tuodecai

铁杆木虫 (著名写手)

10Kb长片段连接求助 急！！！

★ ★
amisking(金币+2,VIP+0): 12-10 11:33
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Originally posted by susizheng at 2009-12-8 18:17:
请问下为什么插入了1kb的片段呢？目的片段没有做回收？

这也是我的搞不明白的，怎么连上都是短片段。因为胶回收后的纯度还是可以的，不应该有那么多短片段的。难道是连接的时候长片段被什么切断了？那么连上的短片段我没有回收，其实也是可以拿去测序看看到底是什么东西，可师兄说没必要。
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8楼2009-12-10 11:27:22
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