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tuodecai铁杆木虫 (著名写手)
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[交流]
【求助/交流】10Kb长片段连接求助 急！！！
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| 向各位仁者求助，谁有连过大片段的经验？或有用过invitrogen TOPO XL PCR Cloning Kit 的吗？该盒子的载体是说可以连3—10kb的片段，我的片段就有10kb，可我连了两次了都没连上的。转化效率特高，每个板上长了几百个，可鉴定插入的都是些才1kb的小片段。希望师兄师姐们给点儿建议，或有更好的载体推荐一下。先谢谢了！ |
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won7
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这个试剂盒我连过3次，均是一次成功，所以感觉这个试剂盒还不错。我也是使用150ul涂板，长得也不少，没有具体估算，但应该在500个以上。我挑12个克隆，有8－10个是与目的片段相等的，测其中2个均为目的片段。只有一次检测中出现1个空载，其余均有插入。 阳性鉴定也是用菌液PCR方法，10ul体积中加1ul菌液。引物用试剂带的通用引物即M13，但酶使用的是TAKARA的LA Taq。我用一般的Taq酶试过，但也没有产物，估计是片段太长，一般的酶难以扩增这么长的。预变性我都是用3min，太长的预变性时间是否有影响很难说，但其实没有必要用10min。 连接模板的浓度我没有测，都是估计的。我想这不是主要问题吧。 建议你采用扩增能够长片段的Taq重新检测一下，你认为没有连上的克隆，这可能是关键，因为我看试剂盒的连接原理，应该不会出现这么高的空载，除非你在电转时没有仔细而造成污染。 最后祝你实验顺利，少挨批评！呵呵 |
7楼2009-12-09 17:02:45
susizheng
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3楼2009-12-08 20:12:49
zhuifeng7000
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