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tuodecai

铁杆木虫 (著名写手)

[交流] 【求助/交流】10Kb长片段连接求助 急!!!

向各位仁者求助,谁有连过大片段的经验?或有用过invitrogen TOPO XL PCR Cloning Kit 的吗?该盒子的载体是说可以连3—10kb的片段,我的片段就有10kb,可我连了两次了都没连上的。转化效率特高,每个板上长了几百个,可鉴定插入的都是些才1kb的小片段。希望师兄师姐们给点儿建议,或有更好的载体推荐一下。先谢谢了!
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tuodecai

铁杆木虫 (著名写手)

10Kb长片段连接求助 急!!!

★ ★
amisking(金币+2,VIP+0): 12-10 11:33
引用回帖:
Originally posted by susizheng at 2009-12-8 18:17:
请问下为什么插入了1kb的片段呢?目的片段没有做回收?

这也是我的搞不明白的,怎么连上都是短片段。因为胶回收后的纯度还是可以的,不应该有那么多短片段的。难道是连接的时候长片段被什么切断了?那么连上的短片段我没有回收,其实也是可以拿去测序看看到底是什么东西,可师兄说没必要。
8楼2009-12-10 11:27:22
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susizheng

木虫 (著名写手)

我們是糖 甜到憂傷


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
请问下为什么插入了1kb的片段呢?目的片段没有做回收?
Thank-you,so-blue.
2楼2009-12-08 18:17:32
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won7

金虫 (小有名气)

★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
amisking(金币+2,VIP+0): 12-8 20:23
我用过invitrogen TOPO XL PCR Cloning Kit 连接3kb的产物,效率很高。估计是你产物没有回收好,回收时不要用EB电泳,否则在紫外线下DNA受到损伤,对连接很有影响。建议用试剂盒附带的燃料和回收试剂回收。
3楼2009-12-08 20:12:49
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zhuifeng7000

至尊木虫 (著名写手)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
引用回帖:
Originally posted by tuodecai at 2009-12-8 11:34:
向各位仁者求助,谁有连过大片段的经验?或有用过invitrogen TOPO XL PCR Cloning Kit 的吗?该盒子的载体是说可以连3—10kb的片段,我的片段就有10kb,可我连了两次了都没连上的。转化效率特高,每个板上长了几百 ...

重新将你的大片段回收下,可能回收的不干净,跑胶的时候把电压放的慢一些,使大片段与小片段彻底分开。还有就是你连的时候是平端连还是用酶切位点呢?
4楼2009-12-08 22:24:24
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