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llzhang2012

[交流] 【交流/求助】克隆基因全长问题2

我对一个已知基因序列进行全长克隆,测序后结果得到的序列只是已知序列的前一部分,全长有1400多bp,但我做出来的只有前面的大概800多bp,请问这是什么原因?
   实验过程中电泳结果都挺好的,酶切结果也是对的,测序后就不行了,是不是失败了?
   谢谢

[ Last edited by amisking on 2009-12-12 at 21:47 ]
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lboo7

银虫 (小有名气)

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1949stone(金币+1,VIP+0):谢谢交流 12-2 11:36
你可以设计多段引物克隆片段,然后载拼接在一起就可以了。
2楼2009-12-02 11:29:06
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lzhwin

木虫 (正式写手)

★ ★ ★
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amisking(金币+2,VIP+0): 12-2 12:32
做全长是不是应该用RACE啊,5‘ 3’分开做。

楼主的意思是你PCR出来的片段是1400bp测序出来只有700?这个不太可能吧?你连进T载后有没有做一下酶切验证?

PS:一个测序反应的有效读长大概只有700-800BP,1400bp需要正相反相两个反应才能测通。
NCBI上的很多预测序列很多都是不准的,我师兄做过一个基因,实际扩出来的就比NCBI上的短很多,后来发现预测序列里多了一段内含子。
3楼2009-12-02 12:16:20
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695

木虫 (职业作家)

用primer walking技术啊
4楼2009-12-02 16:43:03
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zhuifeng7000

至尊木虫 (著名写手)

要测两个反应。
5楼2009-12-02 18:09:40
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yueranwoxin

新虫 (初入文坛)


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你测了几个反应啊,一个反应大概只能测七八百个碱基,要加一个反应
6楼2009-12-12 21:27:59
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