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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【交流/求助】克隆基因全长问题2
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llzhang2012

[交流] 【交流/求助】克隆基因全长问题2

我对一个已知基因序列进行全长克隆，测序后结果得到的序列只是已知序列的前一部分，全长有1400多bp，但我做出来的只有前面的大概800多bp，请问这是什么原因？
   实验过程中电泳结果都挺好的，酶切结果也是对的，测序后就不行了，是不是失败了？
   谢谢

[ Last edited by amisking on 2009-12-12 at 21:47 ]
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1楼 2009-12-02 11:09:43
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lboo7

银虫 (小有名气)
★ ★
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1949stone(金币+1,VIP+0):谢谢交流 12-2 11:36
你可以设计多段引物克隆片段，然后载拼接在一起就可以了。
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2楼2009-12-02 11:29:06
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lzhwin

木虫 (正式写手)
★ ★ ★
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amisking(金币+2,VIP+0): 12-2 12:32
做全长是不是应该用RACE啊，5‘ 3’分开做。

楼主的意思是你PCR出来的片段是1400bp测序出来只有700？这个不太可能吧？你连进T载后有没有做一下酶切验证？

PS:一个测序反应的有效读长大概只有700-800BP，1400bp需要正相反相两个反应才能测通。
NCBI上的很多预测序列很多都是不准的，我师兄做过一个基因，实际扩出来的就比NCBI上的短很多，后来发现预测序列里多了一段内含子。
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3楼2009-12-02 12:16:20
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695

木虫 (职业作家)
用primer walking技术啊
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4楼2009-12-02 16:43:03
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zhuifeng7000

至尊木虫 (著名写手)
要测两个反应。
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5楼2009-12-02 18:09:40
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yueranwoxin

新虫 (初入文坛)
★
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你测了几个反应啊，一个反应大概只能测七八百个碱基，要加一个反应
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6楼2009-12-12 21:27:59
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