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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【交流/求助】关于5‘-RACE和3’-RACE的问题
汕头大学海洋科学接受调剂
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pidou

木虫 (正式写手)

[交流] 【交流/求助】关于5‘-RACE和3’-RACE的问题

1、在获取cDNA全长的时候，5‘-RACE和3’-RACE都是以mRNA为模板，还是以第一链cDNA为模板的呢？？
2、在获取cDNA全长的时候，5‘-RACE和3’-RACE都要使用呢？？还是只使用一种技术就可以了呢？？

期待高手的答复，希望回复的详细一点，谢谢，在线等....

[ Last edited by amisking on 2009-12-23 at 12:22 ]
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1楼 2009-11-19 10:57:41
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liyong1981

金虫 (正式写手)
★
pidou(金币+1,VIP+0):希望高手继续相助 11-19 11:41
不管3还是5都要mRNA做模板的，先逆转录第一链即可，然后用第一链做RACE。获得CDNA全长肯定要两断都要做了！个人认为3RACE容易出啦，因为你有polyA锚定引物。5RACE一般很难做出完整的5端上游序列，即使用试剂盒。但扩出你需要的ORF一半冒得问题。
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2楼2009-11-19 11:04:02
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liyong1981

金虫 (正式写手)
或者送公司做，RACE传统的方法做，很折磨人~
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3楼2009-11-19 11:05:40
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小白3521

金虫 (小有名气)
我的3‘和5’race用的takara的试剂盒，3’比较好做一点，步骤也比较少，5‘复杂一些，都需要用RNA转录成带有试剂盒中的接头引物的cDNA，再P，然后用你获得的5’和3’序列拼接成你的全序列，设计引物，在普通的cDNA中扩全长基因
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4楼2009-11-19 11:13:56
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pidou

木虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by liyong1981 at 2009-11-19 11:04:
不管3还是5都要mRNA做模板的，先逆转录第一链即可，然后用第一链做RACE。获得CDNA全长肯定要两断都要做了！个人认为3RACE容易出啦，因为你有polyA锚定引物。5RACE一般很难做出完整的5端上游序列，即使用试剂盒。但 ...

1、可是第一链cDNA是mRNA的完全克隆吗？？那用反转录酶多克隆点，再测序不就知道cDNA的序列了吗？？
2、5‘-和3’-RACE都做完后，怎么即将这两个连接成一条完整的cDNA 呢？？
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5楼2009-11-19 11:41:22
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liyong1981

金虫 (正式写手)
★
pidou(金币+1,VIP+0):希望继续回答，谢谢 11-19 12:27
扩增出来的第一链CDNA不需要是mRNA的完全克隆啊。后面设计的引物做RACE才是可以扩全长的啊！~
逆转录的CDNA第一链本来就是混合物~
拼接么，很简单的，测序后比较下就OK了啊，或者在你认为的ORF内，在扩增出的3和5两个测序完成的RACE中，在两端再设计引物，扩增基因组CDNA，就OK了~
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6楼2009-11-19 11:49:23
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pidou

木虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by liyong1981 at 2009-11-19 11:49:
扩增出来的第一链CDNA不需要是mRNA的完全克隆啊。后面设计的引物做RACE才是可以扩全长的啊！~
逆转录的CDNA第一链本来就是混合物~
拼接么，很简单的，测序后比较下就OK了啊，或者在你认为的ORF内，在扩增出的3和 ...

那你说的混合物是什么意思呢？？是什么和什么的混合物呢？？如果cDNA不是mRNA的全长反转录的话，那么再做5‘和3‘时候的模板（cdna）就不是完整的，又怎么能最后测出cDNA的全长呢？？
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7楼2009-11-19 12:27:09
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liyong1981

金虫 (正式写手)
★
pidou(金币+1,VIP+0):谢谢，虽然不是完全明白，但是慢慢消化吧 11-19 12:47
你设计的引物和锚定引物，会得到完整序列的，我说了，5RACE自己做的话，UTR很难做得出来的，5端帽子很容易降解掉的。或者买个宝生物的试剂盒吧，简单点~引物设计很重要，可以一次多合成几对，都跑跑看。

混合物么，就是你逆转录的过程中，难免会有其他的的片段，因为你第一步是加的逆转录酶啊，做RACE的时候有特定引物，就会指数倍的扩增你的目的片段

一般3RACE自己做，2天搞定，5RACE就看你的技术和运气了

GOOD LUCK~
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8楼2009-11-19 12:33:08
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liyong1981

金虫 (正式写手)
RACE技术有些过时了，你查查文献，07年左右我记得有篇，替代RACE的PCR技术，据说还不错

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9楼2009-11-19 12:34:31
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西-南

新虫 (初入文坛)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
引用回帖:
Originally posted by liyong1981 at 2009-11-19 12:34:
RACE技术有些过时了，你查查文献，07年左右我记得有篇，替代RACE的PCR技术，据说还不错


请问你说的新技术是什么？
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10楼2009-12-22 19:47:21
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