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pidou

木虫 (正式写手)

[交流] 【交流/求助】关于5‘-RACE和3’-RACE的问题

1、在获取cDNA全长的时候,5‘-RACE和3’-RACE都是以mRNA为模板,还是以第一链cDNA为模板的呢??
2、在获取cDNA全长的时候,5‘-RACE和3’-RACE都要使用呢??还是只使用一种技术就可以了呢??

期待高手的答复,希望回复的详细一点,谢谢,在线等....

[ Last edited by amisking on 2009-12-23 at 12:22 ]
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liyong1981

金虫 (正式写手)



pidou(金币+1,VIP+0):希望继续回答,谢谢 11-19 12:27
扩增出来的第一链CDNA不需要是mRNA的完全克隆啊。后面设计的引物做RACE才是可以扩全长的啊!~
逆转录的CDNA第一链本来就是混合物~
拼接么,很简单的,测序后比较下就OK了啊,或者在你认为的ORF内,在扩增出的3和5两个测序完成的RACE中,在两端再设计引物,扩增基因组CDNA,就OK了~

6楼2009-11-19 11:49:23
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liyong1981

金虫 (正式写手)



pidou(金币+1,VIP+0):希望高手继续相助 11-19 11:41
不管3还是5都要mRNA做模板的,先逆转录第一链即可,然后用第一链做RACE。获得CDNA全长肯定要两断都要做了!个人认为3RACE容易出啦,因为你有polyA锚定引物。5RACE一般很难做出完整的5端上游序列,即使用试剂盒。但扩出你需要的ORF一半冒得问题。
2楼2009-11-19 11:04:02
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liyong1981

金虫 (正式写手)


或者送公司做,RACE传统的方法做,很折磨人~
3楼2009-11-19 11:05:40
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小白3521

金虫 (小有名气)

我的3‘和5’race用的takara的试剂盒,3’比较好做一点,步骤也比较少,5‘复杂一些,都需要用RNA转录成带有试剂盒中的接头引物的cDNA,再P,然后用你获得的5’和3’序列拼接成你的全序列,设计引物,在普通的cDNA中扩全长基因
4楼2009-11-19 11:13:56
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