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yujiaping1

木虫 (著名写手)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
如果想获得全长,目前RACE技术是必需的,通常提取总RNA,然后获得mRNA(此步骤可以选作),然后一般是合成用于3RACE的cDNA,再根据同源序列设计一个锚定引物和PolyT引物做3‘RACE,获得扩增产物后,电泳切胶回收,克隆测序,然后根据测序结果设计一个5’RACE的锚定引物和鸟苷酸帽子特异引物(这个目前都有新的专利),扩增出目的产物,回收克隆测序后,将两段拼接起来获得全长。

我现在正在进行这项工作,我买了clonetech的试剂盒,这是很多有经验人士给我推荐的,看了很多文章也多数使用这个盒子,盒子使用的RNA模板推荐是mRNA,但是总RNA也是可以的
11楼2009-12-22 20:13:35
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西-南

新虫 (初入文坛)


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Originally posted by yujiaping1 at 2009-12-22 20:13:
如果想获得全长,目前RACE技术是必需的,通常提取总RNA,然后获得mRNA(此步骤可以选作),然后一般是合成用于3RACE的cDNA,再根据同源序列设计一个锚定引物和PolyT引物做3‘RACE,获得扩增产物后,电泳切胶回收, ...

我现在也在用clontech的试剂盒扩5’端,试了几次了,都失败了,都是单引物扩增,不知道该怎么解决了
12楼2009-12-23 11:17:55
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yujiaping1

木虫 (著名写手)


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Originally posted by 西-南 at 2009-12-23 11:17:

我现在也在用clontech的试剂盒扩5’端,试了几次了,都失败了,都是单引物扩增,不知道该怎么解决了

一般都是引物问题,可以多设计一些引物,用蛋白保守区设计,如果都不好,还可以用巢式PCR,据我的经验,巢式PCR一般都会扩增出带。
另外,我想知道你的扩增是没有带,还是没有目的条带

我们可以一起讨论一下,我的QQ:124759083
13楼2009-12-28 10:14:41
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西-南

新虫 (初入文坛)


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Originally posted by yujiaping1 at 2009-12-28 10:14:


一般都是引物问题,可以多设计一些引物,用蛋白保守区设计,如果都不好,还可以用巢式PCR,据我的经验,巢式PCR一般都会扩增出带。
另外,我想知道你的扩增是没有带,还是没有目的条带

我们可以一起讨论一 ...

是没有目的条带。用外引物反转录后用内引物扩,只有100的带,用随机引物和oligo dT反转录,做巢式,只有不到一百的带。而且这两个带都很亮。我以前测序过第一次扩增的两个和目的条带大小接近的带,都不是目的条带。
14楼2009-12-30 09:23:31
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genewind

金虫 (小有名气)


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GOOD LUCK 本人原来用的就是传统的RACE技术 感觉还可以吧 关键是你设计的引物得足够好 一般没多大问题的
15楼2009-12-30 14:43:32
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西-南

新虫 (初入文坛)


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Originally posted by 西-南 at 2009-12-30 09:23:

是没有目的条带。用外引物反转录后用内引物扩,只有100的带,用随机引物和oligo dT反转录,做巢式,只有不到一百的带。而且这两个带都很亮。我以前测序过第一次扩增的两个和目的条带大小接近的带,都不是目的条 ...

谢谢,我再改进下看看
16楼2009-12-30 16:47:49
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