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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【交流/求助】关于5‘-RACE和3’-RACE的问题
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yujiaping1

木虫 (著名写手)
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如果想获得全长，目前RACE技术是必需的，通常提取总RNA，然后获得mRNA（此步骤可以选作），然后一般是合成用于3RACE的cDNA，再根据同源序列设计一个锚定引物和PolyT引物做3‘RACE，获得扩增产物后，电泳切胶回收，克隆测序，然后根据测序结果设计一个5’RACE的锚定引物和鸟苷酸帽子特异引物（这个目前都有新的专利），扩增出目的产物，回收克隆测序后，将两段拼接起来获得全长。

我现在正在进行这项工作，我买了clonetech的试剂盒，这是很多有经验人士给我推荐的，看了很多文章也多数使用这个盒子，盒子使用的RNA模板推荐是mRNA，但是总RNA也是可以的
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11楼2009-12-22 20:13:35
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西-南

新虫 (初入文坛)
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Originally posted by yujiaping1 at 2009-12-22 20:13:
如果想获得全长，目前RACE技术是必需的，通常提取总RNA，然后获得mRNA（此步骤可以选作），然后一般是合成用于3RACE的cDNA，再根据同源序列设计一个锚定引物和PolyT引物做3‘RACE，获得扩增产物后，电泳切胶回收， ...

我现在也在用clontech的试剂盒扩5’端，试了几次了，都失败了，都是单引物扩增，不知道该怎么解决了
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12楼2009-12-23 11:17:55
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yujiaping1

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Originally posted by 西-南 at 2009-12-23 11:17:

我现在也在用clontech的试剂盒扩5’端，试了几次了，都失败了，都是单引物扩增，不知道该怎么解决了

一般都是引物问题，可以多设计一些引物，用蛋白保守区设计，如果都不好，还可以用巢式PCR，据我的经验，巢式PCR一般都会扩增出带。
另外，我想知道你的扩增是没有带，还是没有目的条带

我们可以一起讨论一下，我的QQ：124759083
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13楼2009-12-28 10:14:41
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西-南

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Originally posted by yujiaping1 at 2009-12-28 10:14:


一般都是引物问题，可以多设计一些引物，用蛋白保守区设计，如果都不好，还可以用巢式PCR，据我的经验，巢式PCR一般都会扩增出带。
另外，我想知道你的扩增是没有带，还是没有目的条带

我们可以一起讨论一 ...

是没有目的条带。用外引物反转录后用内引物扩，只有100的带，用随机引物和oligo dT反转录，做巢式，只有不到一百的带。而且这两个带都很亮。我以前测序过第一次扩增的两个和目的条带大小接近的带，都不是目的条带。
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14楼2009-12-30 09:23:31
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genewind

金虫 (小有名气)
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GOOD LUCK 本人原来用的就是传统的RACE技术 感觉还可以吧 关键是你设计的引物得足够好 一般没多大问题的
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15楼2009-12-30 14:43:32
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西-南

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Originally posted by 西-南 at 2009-12-30 09:23:

是没有目的条带。用外引物反转录后用内引物扩，只有100的带，用随机引物和oligo dT反转录，做巢式，只有不到一百的带。而且这两个带都很亮。我以前测序过第一次扩增的两个和目的条带大小接近的带，都不是目的条 ...

谢谢，我再改进下看看
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16楼2009-12-30 16:47:49
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