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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 定量PCR的溶解曲线问题
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jia901

铜虫 (小有名气)

[交流] 定量PCR的溶解曲线问题

前些天实验时候，发现样品的溶解曲线俩峰。于是变了下升温程序，结果反而标准样溶解曲线一直有俩峰，而且浓度越低，小点的峰就越高。样品反而只有一个峰，而且标准样的峰跟样品的不太重合。升高了2度退火温度，发现不起作用，片段长度600多。

高手们支个招啊。怎么个情况啊，如果优化的话优化哪些指标啊。
见图。
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1楼 2009-11-13 22:39:23
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jianandy

金虫 (著名写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
小峰应该是引物二聚体，推荐降低反应体系中的引物浓度
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2楼2009-11-14 19:56:49
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jianandy

金虫 (著名写手)
不过不清楚你的标准样跟样品的区别
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3楼2009-11-14 19:58:16
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jjlbest

木虫 (著名写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
做定量PCR片段大小是600多。是不是太大了？合适吗？从峰的位置看好像不是二聚体，应该是非特异性条带，你可以跑个电泳看看，建议重新设计引物。
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4楼2009-11-14 20:05:20
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jia901

铜虫 (小有名气)
引物都是文献上的啊，不是我自己设计的。
跑电泳有轻微的二聚体，而且溶解的温度看的话也不像是引物二聚体。
非特异性的条带也没有。看看电泳图，前面4个是标线的样品。
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5楼2009-11-14 20:20:42
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六妖妖

金虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
lz查文献得到的引物是用来做SYBR的还是做探针的？SYBR的话最好还是400bp以内比较好。从你的电泳图来看，明显有非特异扩增，而且是大片段产物。最根本的解决方法是重新设计引物。实在不愿意重新设计引物就试试温度梯度筛选一个比较好的退火温度。
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6楼2009-11-14 22:35:04
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jia901

铜虫 (小有名气)
非特异扩增很明显么？难道是图片的分辨率问题？不过我不太清楚，定量的PCR仪器上是否能做梯度的？从新设计引物的话工作量大了就。不过还是感谢各位了。
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7楼2009-11-14 22:42:21
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