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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 双酶切问题
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小白3521

金虫 (小有名气)

[交流] 双酶切问题

今天第一次用EcoR1和Xho1做双酶切切质粒，37° 3h，师兄说差不多了，结果切出来，差很多，基本上算是没切动，大家一般做双酶切都是切多长时间啊，体系是怎样呢？
我今天做的1*H 2ul   EcoR1 1ul  Xho1  1ul 质粒 6ul  ddH2O 10ul
总体积20ul
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1楼 2009-11-02 21:20:22
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whisht

银虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
我做酶切时，用的是4小时多一些
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2楼2009-11-02 21:22:23
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小白3521

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by whisht at 2009-11-2 21:22:
我做酶切时，用的是4小时多一些

那你一般加多少质粒呢
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3楼2009-11-02 21:51:03
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迪亚格686

新虫 (初入文坛)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
质粒浓度可能太高了，一般用一微克的质粒 用试剂盒提的质粒浓度在0.3微克/微升左右 你质粒量偏大了
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4楼2009-11-02 22:01:52
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zhuifeng7000

至尊木虫 (著名写手)
★ ★ ★
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amisking(金币+2,VIP+0): 11-2 22:16
引用回帖:
Originally posted by 小白3521 at 2009-11-2 21:20:
今天第一次用EcoR1和Xho1做双酶切切质粒，37° 3h，师兄说差不多了，结果切出来，差很多，基本上算是没切动，大家一般做双酶切都是切多长时间啊，体系是怎样呢？
我今天做的1*H 2ul   EcoR1 1ul  Xho1  1ul 质粒 ...

给你推荐个体系：
Buffer 2X Tango：4ul
             EcoR1 ：1ul  
             Xho1  ：1ul
                质粒：6ul（浓度较高的话）
                dd   ：8ul
37℃，3h。如果只是酶切验证的话，体系减半，酶切1h。构建克隆的话体系增大一倍，酶量不变。
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5楼2009-11-02 22:02:33
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小白3521

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by zhuifeng7000 at 2009-11-2 22:02:

给你推荐个体系：
Buffer 2X Tango：4ul
             EcoR1 ：1ul  
             Xho1  ：1ul
                质粒：6ul（浓度较高的话）
                dd   ：8ul
37℃，3h。如果只是酶切验证的话 ...

弱弱的问一下啊，“Buffer 2X Tango”是何物啊？就是这两个酶的通用缓冲液么？
我准备酶切回收的，那应该增大体系咯？
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6楼2009-11-02 22:14:06
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小白3521

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by 迪亚格686 at 2009-11-2 22:01:
质粒浓度可能太高了，一般用一微克的质粒 用试剂盒提的质粒浓度在0.3微克/微升左右 你质粒量偏大了

我用试剂盒提的，感觉提出来的不是很亮，就多加了一点
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7楼2009-11-02 22:16:11
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zhuifeng7000

至尊木虫 (著名写手)
★
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引用回帖:
Originally posted by 小白3521 at 2009-11-2 22:14:

弱弱的问一下啊，“Buffer 2X Tango”是何物啊？就是这两个酶的通用缓冲液么？
我准备酶切回收的，那应该增大体系咯？

Tango这是个通用Buffer，一般为10X，即一般10ul体积加入1ul，用这两种酶进行双酶切，需要用2X的，是两种酶活均保持100%，即10ul体系加2ul。
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8楼2009-11-02 22:18:00
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
★
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提完要定量
酶最好用好点的，takara出了名要切很久很久还不干净的
建议切完之后挖胶不然转化的时候就很好看了……一堆空的
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9楼2009-11-02 22:18:06
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小白3521

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by 三磷酸腺苷 at 2009-11-2 22:18:
提完要定量
酶最好用好点的，takara出了名要切很久很久还不干净的
建议切完之后挖胶不然转化的时候就很好看了……一堆空的

呃...我是用的TAKARA的
那用什么牌子的酶切的比较好呢
我切了3h，看到了一点点，又做了一些，放到明天早上看看结果
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10楼2009-11-02 22:22:16
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