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Nat Methods∣大连化物所
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大连化物所生物技术研究部生物分离分析新材料与技术研究组（1809组）叶明亮研究员团队和中国科学院上海药物研究所罗成研究员团队合作，利用蛋白质在结合配体后局部稳定性的变化，开发了一种在复杂体系中可以同时高灵敏鉴定配体结合蛋白和结合位点的蛋白质组学新方法。该方法无需对配体进行化学修饰，广谱适用于包括代谢物、药物、污染物等不同结构配体的靶蛋白质分析。 研究人员发现，采用大量的胰蛋白酶对自然状态下的蛋白质进行酶切，使之直接产生适合质谱检测的肽段，能够对配体结合引起的局部稳定性变化产生放大作用。基于该发现，研究人员开发了以肽段为中心的蛋白质局部稳定性探测方法（PEptide-centric Local Stability Assay，PELSA），用于配体靶蛋白质的鉴定。PELSA方法无需对配体进行化学修饰、不依赖亲和力大小，直接能在细胞裂解液等复杂样品中发现与配体结合发生局部稳定性变化的蛋白质，从而实现配体结合蛋白质、结合位点以及局部亲和力的系统解析。 PELSA方法具有较高的鉴定灵敏度，在模型药物星孢菌素靶蛋白的鉴定中，与现有同类的技术（LiP-MS）相比，利用该方法的靶蛋白鉴定灵敏度提高了12倍；与目前广泛使用但缺乏结合位点信息的热蛋白质组技术（TPP）相比，该方法的靶蛋白鉴定灵敏度提高了2.4倍。此外，剂量依赖的PELSA方法可以测定局部亲和力，从而揭示生理状态下蛋白质在结合配体后三维结构的动态变化。研究人员将PELSA方法用于药物、金属离子、翻译后修饰肽段及抗体等多种配体的结合蛋白鉴定，均展现出高灵敏的靶蛋白鉴定性能和精准的结合区域定位能力，证明了PELSA方法可以作为一个通用的分析平台，研究各种配体与蛋白的相互作用。 由于代谢物种类繁多，结构多样，有些分子结构简单，常以接近细胞生理浓度的亲和力（微摩每升到毫摩每升）与感受蛋白相互作用，二者相互作用的解析长期依赖于生物学家的生物学假设和实验，分析通量有限。本工作开发的PELSA方法非常适合代谢物靶蛋白质的系统鉴定，研究人员利用PELSA方法一次性在HeLa细胞裂解液中鉴定到40个α-酮戊二酸的作用蛋白，其中有30个是大量文献积累的已知作用蛋白，说明该方法靶蛋白鉴定的高灵敏度和高可信度。研究人员进一步将PELSA方法应用于叶酸、亮氨酸、富马酸及琥珀酸等代谢物的作用蛋白鉴定，展示了该方法的广谱适用性。 本工作开发的PELSA方法在代谢物、药物及污染物的识别及作用机制解析等领域具有广泛的应用价值。 相关研究成果以“A peptide-centric local stability assay enables proteome-scale identification of the protein targets and binding regions of diverse ligands”为题，于近日发表在《自然-方法》（Nature Methods）上。该工作的第一作者是1809组已毕业博士研究生李柯佳。上述工作得到了国家重点研发计划、国家自然科学基金、大连化物所创新基金等项目的支持。 |
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