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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 我的重组菌为啥不长？
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meizixijun

金虫 (小有名气)

[交流] 我的重组菌为啥不长？

我的载体是pET28a(+),连接一个大约1600bp的基因，可是就是转化不出。感受态对照（转化时只加感受态细胞，其他步骤都一样）在含kana平板上不长，在不含kana的平板上长，这说明感受态制备没问题，那是什么原因导致重组菌不长呢？知道的请帮帮忙啊！是连接出问题吗?我是16度连接16~24h，就是长也就长一株，我快郁闷死了。我的宿主菌直接用BL21的，这个有关系吗？听说一般都先用DH5a

[ Last edited by amisking on 2009-10-25 at 19:20 ]
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追求梦想，快乐着我的快乐
1楼 2009-10-25 18:48:07
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

zier1011

木虫 (著名写手)
同意二楼的，不行就换一批感受态吧，
应该不是连接的问题，就算没连接好，空质粒转进去也改长的呀。
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花还香香的
6楼2009-10-26 15:23:43
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普通回帖

zhuifeng7000

至尊木虫 (著名写手)
★
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引用回帖:
Originally posted by meizixijun at 2009-10-25 18:48:
我的载体是pET28a(+),连接一个大约1600bp的基因，可是就是转化不出。感受态对照（转化时只加感受态细胞，其他步骤都一样）在含kana平板上不长，在不含kana的平板上长，这说明感受态制备没问题，那是什么原因导致重 ...

用Bl21没有问题的。我觉得你做的对照并不能说明你的感受没有问题，很有可能是你的感受态效率太低，或者直接不行了的原因，你做的对照只能说明你的菌为bl21，不能说明他的效率。建议你做的转空质粒的对照试试，如果还不长，说明感受态出问题了！还有就是没有用错抗性板吧？
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2楼2009-10-25 20:08:35
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star1987

木虫 (著名写手)

笑傲江湖
★
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宿主没有问题，很有可能是连接出问题了，你也提到了，就是长也长一株
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3楼2009-10-25 20:27:16
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jjlbest

木虫 (著名写手)
应该是连接出问题。
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4楼2009-10-25 22:24:24
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yzuxhq368

金虫 (小有名气)
★
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用哪家的酶，连接片段的浓度、比例等，都会影响连接效果
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5楼2009-10-25 22:37:10
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scelab

荣誉版主 (文坛精英)

小木虫之有关部门负责人
★
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看看这个也许对你有帮助
http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=1585002&fpage=0&view=&highlight=&page=1
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小木虫之有关部门负责人
7楼2009-10-26 19:22:02
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meizixijun

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by zhuifeng7000 at 2009-10-25 20:08:

用Bl21没有问题的。我觉得你做的对照并不能说明你的感受没有问题，很有可能是你的感受态效率太低，或者直接不行了的原因，你做的对照只能说明你的菌为bl21，不能说明他的效率。建议你做的转空质粒的对照试试，如 ...

先谢谢大家！我的感受态在未加抗生素的平板上长成一片但是单菌落都不大，这可以认为感受态效率低下吗？抗生素用的是kana,没有弄错。

[ Last edited by meizixijun on 2009-10-26 at 21:26 ]
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追求梦想，快乐着我的快乐
8楼2009-10-26 21:24:22
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lamda

木虫 (著名写手)

笨鸟先飞
★
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BL21 适合做表达，不适合做克隆。建议换新的表达菌株如XL1BLUE 或者JM109等。
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低调
9楼2009-10-27 10:26:01
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humants

金虫 (正式写手)
★
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其实你就按二楼的做一下试试，基本上就可以排除问题了，
转入空载的载体要是能成功，则说明你的链接没做好；
要是空载的也转不进去，说明你的感受态没做好或者时间太长死了。
再就是建议先转化到克隆宿主，而不是表达宿主BL21(DE3)，因为你的蛋白在宿主中会有本底表达，如果你的蛋白对宿主的细胞毒性特别大，直接就抑制了宿主的生长，造成假阴性。
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10楼2009-10-27 21:21:40
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