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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 双酶切求助！
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C12ire1

新虫 (初入文坛)

[求助] 双酶切求助！ 已有2人参与

双酶切后载体条带很浅

实验内容是载体和插入片段同时酶切过夜，用的EcoRI和BamHI，片段和载体都是50体系，且都加了500ng,试过把载体加到1000ng，跑出来的条带是插入片段是亮的，载体条带很浅，几乎看不见，测了浓度是载体酶切后在1-2ng/ul,反复酶切过几次都是这种结果，片段是1500bp，载体是改造载体1.6kb求大佬解答！

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1楼 2023-05-11 08:51:33
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KM石头

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
就实验描述来说，应该是质粒本身出了问题，载体在，酶切前有没有重新测一下浓度，看是否降解；如果正常的话，建议重新提取载体质粒，最后洗脱时，用水洗脱，同时注意260/230的比值，低于2.0的话，有机杂质的污染可能会使其降解
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2楼2023-05-11 10:37:14
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ffplant

新虫 (小有名气)
看不太明白你的问题是什么意思，是已经连接好的产物转化增殖后提的质粒酶切有问题还是载体和片段双酶切后连接有问题？
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3楼2023-05-11 11:53:23
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C12ire1

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by KM石头 at 2023-05-11 10:37:14
就实验描述来说，应该是质粒本身出了问题，载体在，酶切前有没有重新测一下浓度，看是否降解；如果正常的话，建议重新提取载体质粒，最后洗脱时，用水洗脱，同时注意260/230的比值，低于2.0的话，有机杂质的污染可能 ...

其实我后面已经重转过了，结果也是差不多，就是感觉载体有问题，但不知道问题在哪儿，后续用酶切产物直接回收，没有跑胶，得到过7-8ng/ul的浓度做了转化，但没有得到阳性菌

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4楼2023-05-11 16:25:39
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C12ire1

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by ffplant at 2023-05-11 11:53:23
看不太明白你的问题是什么意思，是已经连接好的产物转化增殖后提的质粒酶切有问题还是载体和片段双酶切后连接有问题？

是连接之前的双酶切

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5楼2023-05-11 16:27:09
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看我红杖

新虫 (初入文坛)
换个反应buffer试试防止星号活性

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6楼2023-05-11 19:20:49
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看我红杖

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 看我红杖 at 2023-05-11 19:20:49
换个反应buffer试试防止星号活性

比如离子浓度

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7楼2023-05-11 19:21:35
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C12ire1

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 看我红杖 at 2023-05-11 19:20:49
换个反应buffer试试防止星号活性

我现在用的是10×的tango buffer换成其中一种酶的buffer试一试吗

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8楼2023-05-11 19:45:27
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ffplant

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
引用回帖:
5楼: Originally posted by C12ire1 at 2023-05-11 16:27:09
是连接之前的双酶切
...

懂了，你是把载体酶切之后又用琼脂糖凝胶电泳观察到条带几乎不可见是吧，那这就要考虑是不是你酶切时间太久了，导致限制酶乱切，试试减少酶切时间，或换个公司的酶，按理说现在市面上的酶已经很少需要酶切过夜的了

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9楼2023-05-12 12:39:05
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C12ire1

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
9楼: Originally posted by ffplant at 2023-05-12 12:39:05
懂了，你是把载体酶切之后又用琼脂糖凝胶电泳观察到条带几乎不可见是吧，那这就要考虑是不是你酶切时间太久了，导致限制酶乱切，试试减少酶切时间，或换个公司的酶，按理说现在市面上的酶已经很少需要酶切过夜的了
...

我也有过怀疑是否是酶切时间过长，同时也怀疑是否产生星号活性，昨晚换了ecroi的buffer，同样也未改善多少，接下来试一下缩短酶切时间吧，那我大概酶切多长时间呢，用的是赛默飞的酶，推荐时间是1-16小时

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10楼2023-05-12 14:58:25
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