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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 为什么我的融合PCR总是失败
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zljg8260

新虫 (小有名气)

[交流] 为什么我的融合PCR总是失败 已有2人参与

各位大佬，有人知道融合PCR具体怎么做好吗，重叠部分大概多长合适，然后两条模板的量大概要加多少，比如50ul体系，200ng/ul的1000bp的模板应该加多少，预反应的话有什么注意的

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1楼 2023-04-25 22:29:07
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泡沫12

新虫 (小有名气)
★
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A和B片段我一般overlap 30 bp，50ul体系各加200ng，不加引物，PCR 10个循环，之后取2ul做模板，各加1.5ul上下游引物，进行PCR

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2楼2023-04-25 23:16:04
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Glenice Y

新虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
这个实验要注意的细节很多，尤其是同源臂的设计长度，一般我是按照1:1加  这时候你要按照长度计算，加入量的确定，其实一般很少的量就可以了10ng这样子

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3楼2023-04-25 23:56:41
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zljg8260

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 泡沫12 at 2023-04-25 23:16:04
A和B片段我一般overlap 30 bp，50ul体系各加200ng，不加引物，PCR 10个循环，之后取2ul做模板，各加1.5ul上下游引物，进行PCR

预反应的退火温度是根据重叠部分来吗

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4楼2023-04-26 00:12:16
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zljg8260

新虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by Glenice Y at 2023-04-25 23:56:41
这个实验要注意的细节很多，尤其是同源臂的设计长度，一般我是按照1:1加  这时候你要按照长度计算，加入量的确定，其实一般很少的量就可以了10ng这样子

我两边各20，所以有40的同源臂，加的量的话确实按摩尔比一比一来的，但加的挺多，50ul体系加了有一千多ng1000bp的片段

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5楼2023-04-26 00:14:47
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泡沫12

新虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
4楼: Originally posted by zljg8260 at 2023-04-26 00:12:16
预反应的退火温度是根据重叠部分来吗
...

退火温度我一直用的55度，都是可以融合成功的，三个片段也是可以的

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6楼2023-04-26 21:03:16
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