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zljg8260

新虫 (小有名气)

[交流] 为什么我的融合PCR总是失败 已有2人参与

各位大佬,有人知道融合PCR具体怎么做好吗,重叠部分大概多长合适,然后两条模板的量大概要加多少,比如50ul体系,200ng/ul的1000bp的模板应该加多少,预反应的话有什么注意的

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泡沫12

新虫 (小有名气)

★
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A和B片段我一般overlap 30 bp,50ul体系各加200ng,不加引物,PCR 10个循环,之后取2ul做模板,各加1.5ul上下游引物,进行PCR

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2楼2023-04-25 23:16:04
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Glenice Y

新虫 (正式写手)

★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
这个实验要注意的细节很多,尤其是同源臂的设计长度,一般我是按照1:1加  这时候你要按照长度计算,加入量的确定,其实一般很少的量就可以了10ng这样子

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3楼2023-04-25 23:56:41
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zljg8260

新虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by 泡沫12 at 2023-04-25 23:16:04
A和B片段我一般overlap 30 bp,50ul体系各加200ng,不加引物,PCR 10个循环,之后取2ul做模板,各加1.5ul上下游引物,进行PCR

预反应的退火温度是根据重叠部分来吗

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4楼2023-04-26 00:12:16
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zljg8260

新虫 (小有名气)

引用回帖:
3楼: Originally posted by Glenice Y at 2023-04-25 23:56:41
这个实验要注意的细节很多,尤其是同源臂的设计长度,一般我是按照1:1加  这时候你要按照长度计算,加入量的确定,其实一般很少的量就可以了10ng这样子

我两边各20,所以有40的同源臂,加的量的话确实按摩尔比一比一来的,但加的挺多,50ul体系加了有一千多ng1000bp的片段

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5楼2023-04-26 00:14:47
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泡沫12

新虫 (小有名气)

★
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引用回帖:
4楼: Originally posted by zljg8260 at 2023-04-26 00:12:16
预反应的退火温度是根据重叠部分来吗
...

退火温度我一直用的55度,都是可以融合成功的,三个片段也是可以的

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6楼2023-04-26 21:03:16
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