应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 为什么我的融合PCR总是失败
61/1返回列表
查看: 1346  |  回复: 5
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

zljg8260

新虫 (小有名气)

[交流] 为什么我的融合PCR总是失败 已有2人参与

各位大佬，有人知道融合PCR具体怎么做好吗，重叠部分大概多长合适，然后两条模板的量大概要加多少，比如50ul体系，200ng/ul的1000bp的模板应该加多少，预反应的话有什么注意的

发自小木虫Android客户端
回复此楼

» 猜你喜欢
1楼 2023-04-25 22:29:07
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

泡沫12

新虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
A和B片段我一般overlap 30 bp，50ul体系各加200ng，不加引物，PCR 10个循环，之后取2ul做模板，各加1.5ul上下游引物，进行PCR

发自小木虫IOS客户端
赞一下 回复此楼
2楼2023-04-25 23:16:04
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

Glenice Y

新虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
这个实验要注意的细节很多，尤其是同源臂的设计长度，一般我是按照1:1加  这时候你要按照长度计算，加入量的确定，其实一般很少的量就可以了10ng这样子

发自小木虫Android客户端
赞一下 回复此楼
3楼2023-04-25 23:56:41
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

zljg8260

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 泡沫12 at 2023-04-25 23:16:04
A和B片段我一般overlap 30 bp，50ul体系各加200ng，不加引物，PCR 10个循环，之后取2ul做模板，各加1.5ul上下游引物，进行PCR

预反应的退火温度是根据重叠部分来吗

发自小木虫Android客户端
赞一下 回复此楼
4楼2023-04-26 00:12:16
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

zljg8260

新虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by Glenice Y at 2023-04-25 23:56:41
这个实验要注意的细节很多，尤其是同源臂的设计长度，一般我是按照1:1加  这时候你要按照长度计算，加入量的确定，其实一般很少的量就可以了10ng这样子

我两边各20，所以有40的同源臂，加的量的话确实按摩尔比一比一来的，但加的挺多，50ul体系加了有一千多ng1000bp的片段

发自小木虫Android客户端
赞一下 回复此楼
5楼2023-04-26 00:14:47
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

泡沫12

新虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
4楼: Originally posted by zljg8260 at 2023-04-26 00:12:16
预反应的退火温度是根据重叠部分来吗
...

退火温度我一直用的55度，都是可以融合成功的，三个片段也是可以的

发自小木虫IOS客户端
赞一下 回复此楼
6楼2023-04-26 21:03:16
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 zljg8260 的主题更新
61/1返回列表
普通表情 龙 兔 虎 猫 高级回复 (可上传附件)
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 欢迎211本科同学，过A区国家线，A区非偏远一本，交叉学科课题组 +12 lisimayy 2026-03-04 22/1100 2026-03-05 20:26 by 18334623424
[考研] 289求调剂 +3 驰光绝景 2026-03-04 3/150 2026-03-05 20:24 by 热情沙漠
[考研] 求调剂，学校研究所都可以，材料与化工267分 +6 wmx1 2026-03-05 6/300 2026-03-05 20:01 by houyaoxu
[考研] 334求调剂 +4 Trying] 2026-03-05 5/250 2026-03-05 16:47 by zhukairuo
[考研] 材料与化工，291分，求调剂 +9 咕噜咕噜123123 2026-03-04 11/550 2026-03-05 09:03 by 斩魂滴兔子！
[考研] 070300化学 280 一志愿太原理工 求调剂 +8 拾玖壹 2026-03-04 8/400 2026-03-05 08:52 by anny19840123
[考研] 22408-273求调剂-担任3个项目的负责人-1篇国际期刊论文（一作）1篇核心期刊论文在投。 +3 没想好取什么名 2026-03-03 3/150 2026-03-05 08:38 by Destiny688
[考研] 085601 材料工程 320 +6 和乐瑶 2026-03-03 6/300 2026-03-04 16:01 by chixmc
[考研] 291求调剂 +3 咕噜咕噜123123 2026-03-02 4/200 2026-03-04 08:39 by 每天只摆一小会
[考研] 0854总分272 +5 打小就是老实人 2026-03-02 6/300 2026-03-04 01:41 by ouhaiyu
[考研] 291求调剂 +4 Afy123456 2026-03-03 7/350 2026-03-03 22:29 by barlinike
[考研] 化工专硕调剂 +4 利好利好. 2026-03-03 7/350 2026-03-03 21:30 by L135790
[考研] 材料270求调剂 6+6 Eiiiio 2026-03-01 11/550 2026-03-03 15:04 by Phoebelala
[考研] 材料学硕318求调剂 +11 February_Feb 2026-03-01 11/550 2026-03-03 14:24 by NUAAZXWS
[考研] 298求调剂 +10 人间唯你是清欢 2026-02-28 14/700 2026-03-02 22:49 by 人间唯你是清欢
[考研] 材料工程274求调剂 +5 Lilithan 2026-03-01 5/250 2026-03-02 19:39 by caszguilin
[考研] 275求调剂 +7 明远求学 2026-03-01 7/350 2026-03-02 19:22 by zhukairuo
[考研] 一志愿东北大学材料专硕328，求调剂 +3 shs1083 2026-03-02 3/150 2026-03-02 17:27 by houyaoxu
[考研] 材料与化工328求调剂 +3 。，。，。，。i 2026-03-02 3/150 2026-03-02 13:09 by houyaoxu
[考研] 274求调剂 +3 cgyzqwn 2026-03-01 7/350 2026-03-02 10:38 by lature00
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭