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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 细菌16s rDNA测序的问题
汕头大学海洋科学接受调剂
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fanxing001

铜虫 (小有名气)

[交流] 细菌16s rDNA测序的问题

各位，我做细菌16s rDNA的测定，选择了F27和R1492的通用引物，测序前算了一下，结果应该是1492-27=1465个碱基，拿去测序后，发现结果只有1200个碱基（如图），是不是测序人员看到后面结果比较乱就自动停止测序了啊？还有，我给公司打电话，他们说只保证前几百个碱基结果没问题，那我用这几百个碱基序列去BLAST，去判断该细菌所属的种属，结果是否依然具有说服力？

[ Last edited by amisking on 2009-9-24 at 21:16 ]
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1楼 2009-09-24 17:32:48
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fykxy_206

木虫 (正式写手)
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amisking(金币+3,VIP+0): 9-24 21:13
测序的结果显示有重叠的峰，应该是菌有污染。你重新做一次，PCR的东西要灭菌，操作戴手套。细菌很容易污染。

电泳图有吗？有跟目的条带一样大小的带吗？

如果是一条带和目的条带一样，建议做个克隆试试。
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2楼2009-09-24 17:55:17
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fanxing001

铜虫 (小有名气)
应该没问题，前几百个序列图没问题，只是后面的由于太长，所以无法得到很齐整的峰。
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3楼2009-09-24 20:47:10
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annwt

木虫 (正式写手)
★
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500-800是有效的，其他的不保证正确。技术高了应该是600－800左右，
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4楼2009-09-24 21:10:01
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zhuifeng7000

至尊木虫 (著名写手)
★
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为什么不测两个反应呢？这样不就可以保证测出来的都是正确的了吗？
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5楼2009-09-24 21:17:22
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fanxing001

铜虫 (小有名气)
我需要测大量细菌的16s，如果双向的话，造价太高了···    不知道用几百个序列去比对的话，是否具有说服力。
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6楼2009-09-24 23:05:48
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zhuifeng7000

至尊木虫 (著名写手)
★
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引用回帖:
Originally posted by fanxing001 at 2009-9-24 23:05:
我需要测大量细菌的16s，如果双向的话，造价太高了···    不知道用几百个序列去比对的话，是否具有说服力。

不是双向，我们一般侧序的话都是单向的，但是1个反应只能准确测得800bp左右，你要测1500的话需要两个反应，这两个反应都是同向的。你要试验准确，有说服力的话当然要完全测了。
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7楼2009-09-24 23:19:34
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fanxing001

铜虫 (小有名气)
哦，似乎明白你的意思了。就是说，我拿一个测序引物，告诉测序公司给我测2个反应，他们就能在800个碱剂时再加一个反应吗？
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8楼2009-09-24 23:41:57
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smallcat227

木虫 (著名写手)
★
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一个反应只能保证800bp是可靠的，16s肯定要正反两个反应啊，就多30块钱嘛，为了结果准确是必须的啊
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9楼2009-09-25 09:14:14
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njlf1258

★
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不知你测序是在那家公司做的。一般现在大公司使用的测序仪能保证测序到约1200bp。对你来说事先应该对测序公司讲明，你要测通，这样公司就会将你的全序列测出来。
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10楼2009-09-25 10:18:41
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