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fanxing001

铜虫 (小有名气)

[交流] 细菌16s rDNA测序的问题

各位,我做细菌16s rDNA的测定,选择了F27和R1492的通用引物,测序前算了一下,结果应该是1492-27=1465个碱基,拿去测序后,发现结果只有1200个碱基(如图),是不是测序人员看到后面结果比较乱就自动停止测序了啊?还有,我给公司打电话,他们说只保证前几百个碱基结果没问题,那我用这几百个碱基序列去BLAST,去判断该细菌所属的种属,结果是否依然具有说服力?

[ Last edited by amisking on 2009-9-24 at 21:16 ]
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fykxy_206

木虫 (正式写手)

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amisking(金币+3,VIP+0): 9-24 21:13
测序的结果显示有重叠的峰,应该是菌有污染。你重新做一次,PCR的东西要灭菌,操作戴手套。细菌很容易污染。

电泳图有吗?有跟目的条带一样大小的带吗?

如果是一条带和目的条带一样,建议做个克隆试试。
2楼2009-09-24 17:55:17
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fanxing001

铜虫 (小有名气)

应该没问题,前几百个序列图没问题,只是后面的由于太长,所以无法得到很齐整的峰。
3楼2009-09-24 20:47:10
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annwt

木虫 (正式写手)


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500-800是有效的,其他的不保证正确。技术高了应该是600-800左右,
4楼2009-09-24 21:10:01
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zhuifeng7000

至尊木虫 (著名写手)


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为什么不测两个反应呢?这样不就可以保证测出来的都是正确的了吗?
5楼2009-09-24 21:17:22
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fanxing001

铜虫 (小有名气)

我需要测大量细菌的16s,如果双向的话,造价太高了···    不知道用几百个序列去比对的话,是否具有说服力。
6楼2009-09-24 23:05:48
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zhuifeng7000

至尊木虫 (著名写手)


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引用回帖:
Originally posted by fanxing001 at 2009-9-24 23:05:
我需要测大量细菌的16s,如果双向的话,造价太高了···    不知道用几百个序列去比对的话,是否具有说服力。

不是双向,我们一般侧序的话都是单向的,但是1个反应只能准确测得800bp左右,你要测1500的话需要两个反应,这两个反应都是同向的。你要试验准确,有说服力的话当然要完全测了。
7楼2009-09-24 23:19:34
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fanxing001

铜虫 (小有名气)

哦,似乎明白你的意思了。就是说,我拿一个测序引物,告诉测序公司给我测2个反应,他们就能在800个碱剂时再加一个反应吗?
8楼2009-09-24 23:41:57
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smallcat227

木虫 (著名写手)


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一个反应只能保证800bp是可靠的,16s肯定要正反两个反应啊,就多30块钱嘛,为了结果准确是必须的啊
9楼2009-09-25 09:14:14
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njlf1258


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不知你测序是在那家公司做的。一般现在大公司使用的测序仪能保证测序到约1200bp。对你来说事先应该对测序公司讲明,你要测通,这样公司就会将你的全序列测出来。
10楼2009-09-25 10:18:41
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