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caiqingchong木虫 (著名写手)
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关于基因敲除时敲除菌株的筛选问题
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现在用PSUP自杀质粒构建自杀载体后（目的基因内部插入了卡那基因），转到目的菌株内，长出了一片菌落，然后挑取单菌落，分别点到含链霉素+氯霉素平板和链霉素+卡那霉素平板上，野生菌株抗链霉素。 理论上敲除了目的基因的菌株应该是在链霉素+卡那霉素平板上生长但在链霉素+氯霉素平板上不长的，但筛选了几百个菌落，在两个平板上都生长，这是不是说明没有能够敲除啊，如何筛选才能更快的筛除来敲除菌株呢？ |
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caiqingchong
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2楼2009-09-22 08:22:50
caiqingchong
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3楼2009-09-23 22:54:24
zhouzhou_3006
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7楼2009-09-25 20:07:18
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8楼2009-09-25 21:18:20
caiqingchong
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經天 ，你好。我的原始菌是绝对没有卡那抗性的。 我现在搞不懂的是，PSUP这个质粒能在我的菌里复制多久就可以自行消失（别人用过这个质粒敲除，所以用这个自杀质粒没问题）。从我的结果上看，当我转化后长出来一些菌落，这确定是质粒已经转到野生菌里了，但在氯霉素（psup自带抗性）平板上也长的很好，说明这个质粒还存在于菌株中，没有自杀掉。 这里还是关键是如何筛选的问题，我的这个筛选方法是没错的，把同一个单菌落分别接在链霉素+卡那霉素平板上和链霉素+氯霉素平板上。如果在前者长而在后者不长，说明卡那基因已经整合到基因组上了，而且自杀质粒已经消失了。 可我的菌在两种板上都长，这是怎么回事，还有别的筛选方法吗，有的人是随机挑取菌落提基因组，然后PCR扩增鉴定，这样是不是太没目的性了，而且几率不高啊！ 谢谢有经验的虫子来讨论！ |
9楼2009-09-26 08:56:20
caiqingchong
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10楼2009-10-19 13:25:30