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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 关于基因敲除时敲除菌株的筛选问题
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caiqingchong

木虫 (著名写手)

[交流] 关于基因敲除时敲除菌株的筛选问题

现在用PSUP自杀质粒构建自杀载体后（目的基因内部插入了卡那基因），转到目的菌株内，长出了一片菌落，然后挑取单菌落，分别点到含链霉素+氯霉素平板和链霉素+卡那霉素平板上，野生菌株抗链霉素。

        理论上敲除了目的基因的菌株应该是在链霉素+卡那霉素平板上生长但在链霉素+氯霉素平板上不长的，但筛选了几百个菌落，在两个平板上都生长，这是不是说明没有能够敲除啊，如何筛选才能更快的筛除来敲除菌株呢？
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1楼 2009-09-21 16:00:15
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caiqingchong

木虫 (著名写手)
不会没人做吧？
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2楼2009-09-22 08:22:50
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caiqingchong

木虫 (著名写手)
还是没人了解吗？
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3楼2009-09-23 22:54:24
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zhouzhou_3006

木虫 (著名写手)
★
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氯霉素是不是质粒自带的，而卡那是基因内部的插入的，看不太懂，我也是做基因敲除的，但用的是Red 系统
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为梦想努力。
4楼2009-09-23 23:59:55
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蓝皮鼠7983

至尊木虫 (文坛精英)

飞过蓝天
不怎么懂啊
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海到尽头天做岸，山登绝顶我为峰。
5楼2009-09-24 00:59:28
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caiqingchong

木虫 (著名写手)
懂的来说说
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6楼2009-09-25 18:46:54
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zhuifeng7000

至尊木虫 (著名写手)
★
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引用回帖:
Originally posted by caiqingchong at 2009-9-21 16:00:
现在用PSUP自杀质粒构建自杀载体后（目的基因内部插入了卡那基因），转到目的菌株内，长出了一片菌落，然后挑取单菌落，分别点到含链霉素+氯霉素平板和链霉素+卡那霉素平板上，野生菌株抗链霉素。

        理论 ...

也就是说你用氯霉素来作为阴性control的对吧？你的阴性control上都长了很多菌落，你应该先思考一下这是为什么吧！先不要想有没有敲掉。
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7楼2009-09-25 20:07:18
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經天

铁杆木虫 (著名写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
前段时间我也做过，也是插入卡那的，筛选的结果挺好的，你的两个都长，问题可能是：1、你的原始菌株做过卡那的抗性实验吗，有可能是出发菌株具有了卡那的抗性；2、一般缺陷型的构建一个maker gene是不够的，至少需要两个，还要进行目的基因的功能缺失验证，即使长的很多只要最后一步做好了就够了。
另外的野生菌株和突变后的菌株都有链霉素的抗性以后就没有必要再加链霉素了
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一种与世无争的上进，内在的坚毅和质朴无华的大度！【穷吾一生而追求之！】
8楼2009-09-25 21:18:20
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caiqingchong

木虫 (著名写手)
經天 ，你好。我的原始菌是绝对没有卡那抗性的。
我现在搞不懂的是，PSUP这个质粒能在我的菌里复制多久就可以自行消失（别人用过这个质粒敲除，所以用这个自杀质粒没问题）。从我的结果上看，当我转化后长出来一些菌落，这确定是质粒已经转到野生菌里了，但在氯霉素（psup自带抗性）平板上也长的很好，说明这个质粒还存在于菌株中，没有自杀掉。

这里还是关键是如何筛选的问题，我的这个筛选方法是没错的，把同一个单菌落分别接在链霉素+卡那霉素平板上和链霉素+氯霉素平板上。如果在前者长而在后者不长，说明卡那基因已经整合到基因组上了，而且自杀质粒已经消失了。

可我的菌在两种板上都长，这是怎么回事，还有别的筛选方法吗，有的人是随机挑取菌落提基因组，然后PCR扩增鉴定，这样是不是太没目的性了，而且几率不高啊！

谢谢有经验的虫子来讨论！
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9楼2009-09-26 08:56:20
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caiqingchong

木虫 (著名写手)
继续讨论
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10楼2009-10-19 13:25:30
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