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caiqingchong

木虫 (著名写手)

[交流] 关于基因敲除时敲除菌株的筛选问题

现在用PSUP自杀质粒构建自杀载体后(目的基因内部插入了卡那基因),转到目的菌株内,长出了一片菌落,然后挑取单菌落,分别点到含链霉素+氯霉素平板和链霉素+卡那霉素平板上,野生菌株抗链霉素。

        理论上敲除了目的基因的菌株应该是在链霉素+卡那霉素平板上生长但在链霉素+氯霉素平板上不长的,但筛选了几百个菌落,在两个平板上都生长,这是不是说明没有能够敲除啊,如何筛选才能更快的筛除来敲除菌株呢?
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zhouzhou_3006

木虫 (著名写手)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
氯霉素是不是质粒自带的,而卡那是基因内部的插入的,看不太懂,我也是做基因敲除的,但用的是Red 系统
为梦想努力。
4楼2009-09-23 23:59:55
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caiqingchong

木虫 (著名写手)

还是没人了解吗?
3楼2009-09-23 22:54:24
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zhuifeng7000

至尊木虫 (著名写手)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
引用回帖:
Originally posted by caiqingchong at 2009-9-21 16:00:
现在用PSUP自杀质粒构建自杀载体后(目的基因内部插入了卡那基因),转到目的菌株内,长出了一片菌落,然后挑取单菌落,分别点到含链霉素+氯霉素平板和链霉素+卡那霉素平板上,野生菌株抗链霉素。

        理论 ...

也就是说你用氯霉素来作为阴性control的对吧?你的阴性control上都长了很多菌落,你应该先思考一下这是为什么吧!先不要想有没有敲掉。
7楼2009-09-25 20:07:18
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經天

铁杆木虫 (著名写手)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
前段时间我也做过,也是插入卡那的,筛选的结果挺好的,你的两个都长,问题可能是:1、你的原始菌株做过卡那的抗性实验吗,有可能是出发菌株具有了卡那的抗性;2、一般缺陷型的构建一个maker gene是不够的,至少需要两个,还要进行目的基因的功能缺失验证,即使长的很多只要最后一步做好了就够了。
另外的野生菌株和突变后的菌株都有链霉素的抗性以后就没有必要再加链霉素了
一种与世无争的上进,内在的坚毅和质朴无华的大度!【穷吾一生而追求之!】
8楼2009-09-25 21:18:20
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